實驗分享：石蠟切片免疫組化染色步驟

　　1、載玻片的處理：

　　抗原修復過程中，由于高溫、高壓、輻射等諸多因素的影響，極易造成脫片。為保證試驗的正常進行，可選用我公司提供的ZLI-9001 APES、ZLI-9003 HistogripTM或ZLI-9005 Poly-L-Lysine等幾種試劑，對已清洗的載玻片進行處理。古朵技術總結具體方法如下：

　　1.1 APES：現用現配。將洗凈的玻片放入以1:50比例丙酮稀釋的APES中，停留20~30秒鐘，取出稍停片刻，再入純丙酮溶液或蒸餾水中涮去未結合的APES，置通風櫥中晾干即可。用此載玻片撈片時應注意組織要一步到位，并盡量減少氣泡的存在，以免影響染色結果。

　　1.2 HistogripTM：將洗凈的玻片放入以1:50比例丙酮稀釋的Histogrip液中，停留1~2分鐘，然后用雙蒸水快速清洗三次，室溫干燥或60oC烤箱烘烤一小時，裝盒備用。

　　1.3 Poly-L-Lysine：將洗凈、干燥的載玻片放入以1:10比例去離子水稀釋的多聚賴氨酸溶液中，浸泡5分鐘，60oC烤箱烘烤一小時或室溫過夜干燥。裝盒備用。試驗中使用的器具均為非玻璃制品。

　　2、常用酶消化：

　　2.1 胰蛋白m：一般使用濃度為0.05%~0.1%，消化時間為37℃、10~40分鐘，主要用于細胞內抗原的顯示。

　　2.2 胃蛋白m：一般使用濃度為0.4%，消化時間為37℃、30~180分鐘，主要用于細胞間質抗原的顯示，如：Laminin(層粘蛋白)，Collagen IV(IV型膠原)等。

　　2.3 皂素(Saponin)：一般使用濃度為2~10mg/ml的saponin溶液，消化時間為室溫孵育30分鐘。

　　3、抗原熱修復：

　　可根據實驗室的具體條件，選用微波爐抗原修復、高壓鍋抗原修復或水浴高溫抗原修復?？乖瓱嵝迯涂蛇x用各種緩沖液，如TBS、PBS、重金屬鹽溶液等，但實驗證明，以0.01M枸櫞酸鹽緩沖液(pH6.0)效果好。請選用我公司提供的ZLI-9064 枸櫞酸鹽緩沖液(粉劑)配制，取該粉劑一包溶于1000ml的蒸餾水中，混勻，其pH值在6.0 ± 0.1，如因蒸餾水本身造成的pH值偏差，請自行調整。

　　3.1 石蠟切片微波爐抗原修復操作方法：切片脫蠟至水后，3%H2O2處理10分鐘，蒸餾水洗2分鐘×3。將切片放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液(工作液)的容器中，置微波爐內加熱使容器內液體溫度保持在92℃~98℃之間并持續10~15分鐘(注意：無論是使用醫用或家用微波爐，請根據具體機型酌情設置條件，務必滿足以上步驟中對溫度和時間的要求)。取出容器，室溫冷卻10~20分鐘(注意：不可將切片從緩沖液中取出冷卻，以便使蛋白能夠恢復原有的空間構型)。PBS洗，下接免疫組化染色步驟。

　　3.2 石蠟切片高壓抗原修復操作方法：切片脫蠟至水。將1500ml~3000ml的枸櫞酸鹽緩沖液(工作液)注入不銹鋼壓力鍋中加熱至沸騰。切片置于金屬架上，放入鍋內，使切片位于液面以下，蓋鍋壓閥。當壓力鍋開始慢慢噴氣時(約加熱5~6分鐘后)，計時1~2分鐘，然后將壓力鍋端離熱源，冷水沖至室溫后，取下氣閥，打開鍋蓋，取出切片，蒸餾水洗后，PBS洗2分鐘×3，下接免疫組化染色步驟。

　　3.3 石蠟切片電爐煮沸抗原修復操作方法：切片脫蠟至水后，放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液(工作液)的容器中，并將此容器置于盛有一定數量自來水的大器皿中，電爐上加熱煮沸，從小容器的溫度到達92℃~98℃起開始計時15~20分鐘，然后端離電爐，室溫冷卻20~30分鐘，蒸餾水沖洗，PBS洗，下接免疫組化染色步驟。

　　4、免疫組化染色步驟：

　　(以美國ZYMED公司SP試劑盒為例)

　　4.1石蠟切片脫蠟至水。

　　4.2 3%H2O2室溫孵育5~10分鐘，以消除內源性過氧化物酶的活性。

　　4.3蒸餾水沖洗，PBS浸泡5分鐘，(如需采用抗原修復，可在此步后進行)。

　　4.4 5~10%正常山羊血清(PBS稀釋)封閉，室溫孵育10分鐘。傾去血清，勿洗，滴加適當比例稀釋的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小時或4℃過夜。

　　4.5 PBS沖洗，5分鐘×3次。

　　4.6滴加適當比例稀釋的生物s標記二抗(1%BSA-PBS稀釋)，37℃孵育10~30分鐘;或滴加第二代生物s標記二抗工作液，37℃或室溫孵育10~30分鐘。

　　4.7 PBS沖洗，5分鐘×3次。

　　4.8滴加適當比例稀釋的辣根酶標記鏈霉卵白素(PBS稀釋)，37℃孵育10~30分鐘;或第二代辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37℃或室溫孵育10~30分鐘。

　　4.9 PBS沖洗，5分鐘×3次。

　　4.10顯色劑顯色(DAB或AEC)。

　　4.11自來水充分沖洗，復染，封片。

　　冰凍切片免疫組化染色步驟

　　冰凍切片4~8mm，室溫放置30分鐘后，入4℃丙酮固定10分鐘，PBS洗，5分鐘×3。用3%過氧化氫孵育5~10分鐘，消除內源性過氧化物酶的活性。PBS洗，5分鐘×2。

　　石蠟切片免疫組化染色步驟上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦東新區。是一家專門從事生物技術相關產品，勵志研發和銷售的綜合性生物公司，產品遠銷多個國家和地區，我們將一如既往地秉承“一切為了滿足客戶的需求"的經營宗旨;牢固樹立“以客戶需求為準則、以市場需求為導向，不斷開發高質量的新產品，提供客戶滿意的綜合服務質量"的方針。古朵試劑盒