多重熒光免疫組化染色試劑盒(組合系列)

　　組織微環境中有復雜的細胞組成，這些細胞的表型、狀態、豐度、分布都有著重要的生物學意義和臨床價值。借助抗體染色可以將其在組織原位上呈現出來。免疫組化染色是一種研究組織形態和原位蛋白表達的常見技術，常規IHC檢測只能展示單一指標，難以呈現復雜的組織微環境中的細胞組成、狀態和關系，而這些信息對疾病的診斷和治療至關重要!

　　酪氨信號放大技術原理：類似常規免疫組化的DAB顯色方法，TSA技術同樣采用HRP標記的二抗，HRP催化加入體系的熒光素底物，生產活化熒光底物，活化底物可與抗原上的酪氨s共價結合，使樣品上穩定的共價結合熒光素。之后用熱修復法洗去非共價結合的抗體，在換下一種一抗來第二輪孵育，換另一種熒光素底物，如此往復就可實現多重標記。

　　應用主要用于人源或小鼠組織、石蠟切片、TMA芯片的免疫組化染色。

　　使用方法樣本要求：

　　1. 福爾馬林固定的蠟塊或玻片，大塊組織或TMA，封蠟不能有明顯的破損。

　　2. 玻片樣本，組織需要緊貼玻片，避免褶皺，玻片不能有破損、劃傷或污漬。

　　3. 組織最小應包含大于1000 個細胞。

　　4. 蠟塊需包埋實體瘤組織，壞死瘤組織、細針穿刺物、細胞甩片樣品會影響染色效果。

　　5. 組織應當用10%中性福爾馬林固定，正常固定時間為18～24 小時。

　　6. 切片厚度為4um 左右，使用防脫玻片。建議玻片在固定后一周內制備為佳。

　　7. 不要在水浴撈片環節添加任何粘合劑，樣本應置于玻片正面、中央。將撈片豎直置于吸水紙上去除水分，輕敲去除水滴。

　　8. 切片后玻片置于40℃干燥箱上放置30min，確保水分去除、貼片牢固。

　　試劑準備：

　　1) TBST 洗液：25 mM TRIS-HCl (pH 7.5)，150 mM NaCl，0.05% Tween®20 (v/v)

　　2) 抗原修復液：根據一抗選擇檸檬酸鈉或者EDTA修復液

　　3) 抗體稀釋液：可做抗體稀釋和封閉使用，即用型

　　4) 一抗工作液：現用現配，根據預實驗條件優化濃度

　　5) 二抗工作液：二抗工作液為HRP-羊抗鼠兔或兔雙抗

　　6) 熒光染料染色工作液：系列單色熒光染料為200X 母液，使用前用TSA 信號放大反應液1:

　　200 稀釋用配好的工作液4℃保存，僅限當天使用。

　　7) DAPI 工作液：DAPI 使用無菌水按1：100稀釋制備工作液

　　操作步驟：建議采用實驗操作表格進行記錄

　　1. 樣品脫蠟準備：

　　a) 溫箱設置到55℃-60℃，烤片1h 以上。

　　b) 新鮮二甲苯浸片10min，重復3 次。

　　c) 梯度乙醇浸片：100% 3min;95% 3min;70% 3min。

　　d) 滅菌水洗片1min，重復3 次。

　　2. 多重熒光免疫組化染色步驟(A、B、C 三種抗體為例) ：

　　A 抗體

　　A.1 抗原修復：把1X 抗原修復液倒入修復杯中微波爐高火加熱3min 煮沸，立刻放入切片，低火(約20%功率) 繼續加熱15min 后冷卻至室溫。進行該步驟之前建議不放樣品進行一次預實驗，檢測15min 后液面是否高于樣品，避免干片，抗原修復液不能2 次使用。

　　A.2 封閉：去除玻片上殘存洗液，用組化筆圈出玻片上的樣本區域，滴加抗體稀釋液/封閉液，覆蓋樣本區域， 室溫孵育10min。

　　A.3 一抗孵育：用抗體稀釋液按照推薦比例稀釋A 抗體，去除玻片上的封閉液，加一抗至覆蓋樣本，室溫孵育30min，用1X TBST 浸洗玻片3 次，每次2 分鐘。

　　A.4 二抗孵育：去除玻片上殘存的洗液，滴加羊抗鼠兔HRP 標記二抗抗體，浸沒樣本區域，室溫孵育10min，用1X TBST 浸洗玻片3 次，每次2 分鐘。

　　A.5 熒光染色放大信號：去除玻片上殘存的洗液，滴加熒光染料染色工作液，室溫孵育10min，用1X TBST 浸洗玻片3 次，每次2 分鐘。

　　A.6 微波修復：把1X 抗原修復液倒入修復杯中微波爐高火加熱3min，立刻放入切片，低火(約20%功率)繼續加熱10min 后冷卻至室溫。

　　B 抗體

　　B.1 封閉：去除玻片上殘存洗液，用組化筆圈出玻片上的樣本區域，滴加抗體稀釋液/封閉液，覆蓋樣本區域， 室溫孵育10min。

　　B.2 一抗孵育：用抗體稀釋液按照推薦比例稀釋B 抗體，去除玻片上的封閉液，加一抗至覆蓋樣本，室溫孵育30min，用1X TBST 浸洗玻片3 次，每次2 分鐘。

　　B.3 二抗孵育：去除玻片上殘存的洗液，滴加羊抗鼠兔HRP 標記二抗抗體，浸沒樣本區域，室溫孵育10min，用1X TBST 浸洗玻片3 次，每次2 分鐘。

　　B.4 熒光染色放大信號：去除玻片上殘存的洗液，滴加熒光染料染色工作液，室溫孵育10min，用1X TBST 浸洗玻片3 次，每次2 分鐘。

　　B.5 微波修復：把1X 抗原修復液倒入修復杯中微波爐高火加熱3min，立刻放入切片，低火(約20%功率) 繼續加熱10min 后冷卻至室溫。

　　C 抗體

　　C.1 封閉：去除玻片上殘存洗液，用組化筆圈出玻片上的樣本區域，滴加抗體稀釋液/封閉液，覆蓋樣本區域， 室溫孵育10min。

　　C.2 一抗孵育：用抗體稀釋液按照推薦比例稀釋C 抗體，去除玻片上的封閉液，加一抗至覆蓋樣本，室溫孵育30min，用1X TBST 浸洗玻片3 次，每次2 分鐘。

　　C.3 二抗孵育：去除玻片上殘存的洗液，滴加羊抗鼠兔HRP 標記二抗抗體，浸沒樣本區域，室溫孵育10min，用1X TBST 浸洗玻片3 次，每次2 分鐘。

　　C.4 熒光染色放大信號：去除玻片上殘存的洗液，滴加熒光染料染色工作液，室溫孵育10min，用1X TBST 浸洗玻片3 次，每次2 分鐘。

　　C.5 微波修復：把1X 堿性抗原修復液倒入修復杯中微波爐高火加熱3min，立刻放入切片，低火(約20%功率) 繼續加熱10min 后冷卻至室溫。

　　每輪染色結束后可用熒光顯微鏡確認染色情況，注意用TBST 覆蓋樣品，防止干片。

　　3. DAPI 復染及封片：

　　去除玻片上殘存洗液，滴加DAPI 工作液，室溫孵育5min，用1X TBST 浸洗玻片2 分鐘，用滅菌水洗片2 分鐘， 在樣品上滴加適量抗淬滅封片劑，加蓋玻片，小心排除氣泡，用透明指甲油封住蓋玻片四周，室溫晾干，4℃ 避光保存。

　　4. 成像：

　　選用成像設備按照染料光譜條件設置拍攝條件，對染色后的組織片在熒光顯微鏡下數據并進行

　　判讀分析。

　　多重熒光免疫組化染色試劑盒上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦東新區。是一家專門從事生物技術相關產品，勵志研發和銷售的綜合性生物公司，產品遠銷多個國家和地區，我們將一如既往地秉承“一切為了滿足客戶的需求"的經營宗旨;牢固樹立“以客戶需求為準則、以市場需求為導向，不斷開發高質量的新產品，提供客戶滿意的綜合服務質量"的方針。古朵試劑盒