體細(xì)胞胚誘導(dǎo)
1. 實驗材料: 胡蘿卜種子。
2. 培養(yǎng)基
2.1 胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基
MS無機(jī)鹽附加:煙酸0.05mgL-1、VB6和VB1各0.01mgL-1、甘氨酸3mgL-1、肌醇100mgL-1、激動素0.2mgL-1、2,4—D 0.1mgL-1、蔗糖20gL-1、瓊脂2-5gL-1,pH5.8。
2.2 體細(xì)胞胚形成培養(yǎng)基
MS無機(jī)鹽附加:煙酸0.05mgL-1、VB6和VB1各0.01mgL-1、甘氨酸3mgL-1、肌醇100mgL-1、激動素0.2mgL-1、蔗糖20gL-1,pH5.8。
3. 實驗過程
a. 煙草種子以10%次氯酸鈣溶液表面消毒15min,用無菌蒸餾水洗3次,置于培養(yǎng)皿內(nèi)無菌的濕潤濾紙上,在25℃下于暗處萌發(fā);
b. 取7日齡幼苗切取下胚軸部位長1cm,單個地置于胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,接種好的材料置于25℃溫度下黑暗培養(yǎng)4-6周;
c. 將愈傷組織小塊轉(zhuǎn)移到與原來成分相同的新鮮培養(yǎng)基上,一半置于于25℃下照光培養(yǎng),另一半繼續(xù)在黑暗條件下培養(yǎng),若以類似方式每4周繼代1次,可對組織進(jìn)行繁殖;
d. 誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎發(fā)生:將在光照下繼代培養(yǎng)的愈傷組織塊轉(zhuǎn)移到不含2,4—D的培養(yǎng)基中培養(yǎng),3~4周后,將出現(xiàn)大量的各處在不同的發(fā)育階段的體細(xì)胞胚。
e. 觀察體細(xì)胞胚的發(fā)育過程,統(tǒng)計每個愈傷組織形成的體細(xì)胞胚數(shù),統(tǒng)計不同發(fā)育時期的體細(xì)胞胚占胚總數(shù)的比例,分析培養(yǎng)中體細(xì)胞胚形成的時間、控制其一致性可能采取得調(diào)控措施。