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實時熒光定量 PCR (RT-qPCR) 是一種用于實時擴增和檢測特定 DNA 或 RNA 序列的分子生物學技術。該方法利用熒光染料或探針,當與擴增的 DNA 或 RNA 分子結合時會發出信號,從而可以對目標序列進行量化。RT-qPCR 通常用于基因表達分析、病毒載量定量和基因突變檢測等應用。
RT-qPCR原理的三個主要步驟:
1 反轉錄:
· 使用逆轉錄酶和特定引物將RNA樣品反轉錄成cDNA。
· 該步驟將RNA模板轉化為更穩定且可擴增的DNA形式。
· 反轉錄過程中使用特定引物。
2 PCR擴增:
· 使用特定引物對cDNA進行PCR擴增,這些引物環繞目標區域。
· PCR是一個循環過程,呈指數級擴增DNA模板的數量。
· PCR反應中包含熒光染料或探針,它們結合到擴增的DNA序列上并發出熒光信號。
3 熒光實時檢測:
· 使用實時PCR儀器實時監測熒光信號。
· 熒光的數量與每個PCR循環中擴增的DNA數量成比例。
· 使用專業軟件分析數據以確定循環閾值(Ct)值,該值表示熒光信號達到特定閾值水平所需的循環數。Ct值用于計算原始樣品中存在的目標DNA量,從而允許進行基因表達或病毒載量等定量分析。
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