古朵帶認(rèn)識(shí)HE染色的基本原理

　　古朵生物介紹一種細(xì)胞實(shí)驗(yàn)常用的染色方法，即蘇木精—伊紅染色法 (hematoxylin-eosin staining)，簡(jiǎn)稱(chēng)HE染色法。

　　一、HE染色基本原理

　　(1)細(xì)胞核染色原理

　　蘇木精為堿性天然染料，可使細(xì)胞核著色。細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)的成分主要是DNA，在DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)中，兩條核苷酸鏈上的磷酸基向外，使DNA雙螺旋的外側(cè)帶負(fù)電荷，呈酸性，很容易與帶正電荷的蘇木精堿性燃料以離子鍵或氫鍵結(jié)合而被染色。蘇木精在堿性溶液中呈藍(lán)色，所以細(xì)胞核被染成藍(lán)色。

　　(2)細(xì)胞漿染色原理

　　細(xì)胞漿內(nèi)主要成分是蛋白質(zhì)，為兩性化合物、細(xì)胞漿的染色與pH值有密切關(guān)系，當(dāng)pH調(diào)到蛋白質(zhì)等電點(diǎn)4.7-5.0時(shí)，胞漿對(duì)外不顯電性，此時(shí)酸或堿性染料不易染色。當(dāng)pH調(diào)到6.7-6.8時(shí)，大于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)pH值，表現(xiàn)酸性電離，而帶負(fù)電荷的陰離子，可被帶正電荷的染料染色，現(xiàn)時(shí)胞核也被染色，核和胞漿難以區(qū)分。因此必須把pH調(diào)至胞漿等電點(diǎn)以下，在染液中加入醋酸使胞漿帶正電荷(陽(yáng)離子)，就可被帶負(fù)電荷(陰離子)的染料染色。伊紅Y是一種化學(xué)合成的酸性染料，在水中離解成帶負(fù)電荷的陰離子，與蛋白質(zhì)的氨基正電荷(陽(yáng)離子)結(jié)合而使細(xì)胞漿染色，細(xì)胞漿、紅細(xì)胞、肌肉、結(jié)締組織，嗜伊紅顆料等被感染成不同程度的紅色或粉紅色，與藍(lán)色的細(xì)胞核形成鮮明的對(duì)比。

　　(3)細(xì)胞HE染色流程

　　培養(yǎng)的細(xì)胞HE染色過(guò)程與組織切片的染色過(guò)程基本相同，包括樣品制備、染細(xì)胞核、染細(xì)胞質(zhì)、脫水、透明、封固和觀察等步驟。

　　1.樣品制備

　　細(xì)胞：取細(xì)胞密度約為1×105/mL接種于含蓋玻片的培養(yǎng)瓶中，放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時(shí)間，待細(xì)胞基本長(zhǎng)成單層，取出長(zhǎng)有細(xì)胞的蓋玻片，用PBS洗3次。

　　2.染細(xì)胞核

　　①.固定

　　1)將蓋玻片浸入95%乙醇固定15min，PBS洗2次，每次1min;

　　2)浸入蘇木精染液，染色5-10min。

　　②.分色

　　1)自來(lái)水浸洗，浸入稀xys乙醇溶液進(jìn)行分色，數(shù)秒即可;

　　2)自來(lái)水浸洗，浸入淡氨水中，使胞核藍(lán)化3-5min;

　　3)自來(lái)水浸洗。

　　③.染細(xì)胞質(zhì)

　　1)浸入伊紅染液，染色5-10min;

　　2)自來(lái)水浸洗;

　　3.脫水

　　逐級(jí)脫水：經(jīng)70%、80%、90%乙醇各脫水1次，95%乙醇脫水2次，bai分百的乙醇脫水3次，每次1min。

　　4.透明

　　二甲苯透明3次，每次1min。

　　5.封固

　　在載玻片上滴加中性樹(shù)膠，將有細(xì)胞一面的蓋玻片向下封固于載玻片上。

　　6.觀察

　　光鏡下觀察，細(xì)胞質(zhì)呈粉紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)紫色。

　　注意事項(xiàng)：

　　①.染色時(shí)調(diào)節(jié)pH值很重要。如果組織塊在福爾馬林中固定時(shí)間長(zhǎng)，組織酸化而影響細(xì)胞核著色。因此要在自來(lái)水中沖洗時(shí)間長(zhǎng)一些或在飽和tan酸鋰水溶液中處理10-30min，這樣可以使細(xì)胞核著色較深。染伊紅時(shí)胞漿著色不佳，可在伊紅溶液中滴加1-2滴冰醋酸。

　　②.切片染蘇木精后，分色這一步是關(guān)鍵，應(yīng)在顯微鏡下控制進(jìn)行，一般以細(xì)胞核染色清楚而細(xì)胞質(zhì)基本無(wú)色為佳。如果過(guò)分延長(zhǎng)分色時(shí)間將導(dǎo)致染色太淺，應(yīng)重新染色后再行分色。

　　③.切片經(jīng)酒精脫水后，入二甲苯時(shí)可出現(xiàn)白色不透明狀態(tài)，此為脫水不che底，應(yīng)將切片退回wu水酒精，換酒精、二甲苯，以求che底脫水與透明。

　　④.在染色過(guò)程中不要讓切片干燥，以免切片收縮、變形，影響神經(jīng)元形態(tài)。

　　⑤.切片從二甲苯取出或進(jìn)入二甲苯前，切片周邊均應(yīng)擦干凈或吸干多余水分。

　　⑥.zui后封固時(shí)，要用中性樹(shù)脂，防止日后褪色，蓋片要選大于組織塊的面積，如漏出一部分不久將會(huì)褪色，所用樹(shù)脂濃度要適當(dāng)，樹(shù)脂封固時(shí)不能有氣泡。

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