標(biāo)記蛋白抗體/葡聚糖制備方法及操作步驟

  一般每個(gè)抗體可以標(biāo)記3-5個(gè)，標(biāo)記時(shí)，與抗體的比率受抗體濃度影響，對于10 mg/ml 的抗體溶液來說，應(yīng)過蛋白12倍（摩爾數(shù)），對于2 mg/ml 的抗體溶液應(yīng)過20倍，也可以直接以粉末的形式加入蛋白溶液中。

    蛋白樣品不得含有疊氮鈉、BSA、甘氨酸、Tris或其他有自由氨基的添加物。

一、試劑和器材：

1、 標(biāo)記反應(yīng)溶液：0.1M  pH 7.2 PBS（0.15M sodium chloride）

NaCl 8.77 g ；Na₂HPO₄·12H₂O 32.3g ；NaH₂PO₄·2H₂O 4.5g；加雙蒸水 900mL 左右，用HCl/NaOH 調(diào)pH 7.2，后定容為 1000mL

2、 10mM NHS-dPEG4-Biotin配方：稱取0.56mg NHS-dPEG4-Biotin（分子量為587） ，溶解于95 µl 純水中，臨用前配置，不可儲(chǔ)存，立刻使用。NHS-PEG4-Biotin容易潮解，開瓶前平衡室溫。也可以配置200 nmol/L 儲(chǔ)備液：20mg NHS-dPEG4-Biotin 溶解于170µl DMSO中，-20℃穩(wěn)定幾個(gè)月。

由于NHS-PEG4-Biotin昂貴，而且使用量少，不能保存，配制時(shí)，直接將NHS-PEG4-Biotin放入1.5ml EP管中，以實(shí)際稱量的NHS-PEG4-Biotin按比率加入純水。

3、濾管

⑴、Millipore濾管[0.5ml 10KD]:截留分子量10KD，殘留體積200µl，蛋白回收率95%，7500×g（允許的大離心力14000×g）離心10min。

⑵、Millipore濾管[0.5ml 50KD]:截留分子量50KD，殘留體積80µl，蛋白回收率94%，7500×g（允許的大離心力14000×g）離心5 min。

⑶、Amicon Ultra -0.5ml離心濾管（Millipore），，的終濃縮物體積：5-15ul。

二、抗體濾處理

標(biāo)記前需要應(yīng)用截留分子量為50kDa 的濾柱對抗體進(jìn)行標(biāo)記前純化處理(如果不是抗體，要按蛋白分子量來確定濾柱截留分子量)，以除去蛋白樣品中可能含有的疊氮鈉、BSA、甘氨酸、Tris或其他有自由氨基的添加物，干擾標(biāo)記反應(yīng)。

具體操作步驟：

1、 于濾柱中加入200μl 標(biāo)記反應(yīng)溶液，加入500ug 單克隆抗體，混勻。

2、 4℃，6000rpm，離心2min。棄濾液。

3、于濾柱中加入100μl 標(biāo)記反應(yīng)溶液，混勻。4℃，Max 14000×g，2min。

4、 重復(fù)步驟2 6到7次。

5、 混勻?yàn)V柱中的殘留的液體，室溫靜置1min。

6、 將濾柱反轉(zhuǎn)倒置于一新的濾管中，4℃，1000×g，2min，收集濾液。

7、 取50μl PBS于濾柱中混勻，靜置1min。

8、 倒置濾柱，4℃，6000rpm，2min。收集濾液，與步驟6的濾液合并，4℃放置備用。用標(biāo)記反應(yīng)溶液調(diào)節(jié)抗體濃度到2mg/ml （0.25ml）。

三、標(biāo)記抗體

1、 計(jì)算抗體標(biāo)記需要用量。 

    抗體濃度 2 mg/ml時(shí)的簡要計(jì)算：

1mL of 2 mg/mL IgG (150,000 MW)需要26 μL of  10mM  NHS-PEG4-Biotin

具體計(jì)算方式見附錄一（標(biāo)記計(jì)算）

2、 濾后的濾液加入NHS-PEG4-Biotin溶液，室溫反應(yīng)1h。

3、 葡聚糖凝膠分離純化(游離)：

四、葡聚糖凝膠分離純化標(biāo)記抗體操作步驟：

   （一）、試劑：

 1、純化柱處理液 :100 mmol/L Na0H;

 2、純化柱平衡液: 50mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.4)，每升含0.5g NaN₃ ，8g NaCl;

3、樣品洗脫液:同純化柱平衡液;

4、標(biāo)記抗體保護(hù)液（50×）: 10ml0.01M pH7.2 PBS 中加入0.5g BSA，0.2g NaN3。

（二）、凝膠過濾：

    方法見“凝膠過濾法純化微量標(biāo)記蛋白”

五、標(biāo)記抗體的保存方法

    將“標(biāo)記抗體保護(hù)液（50×）”加入到標(biāo)記抗體溶液中，使BSA終濃度為0.1%，4 ℃ 或-20 ℃ 保存。

六、數(shù)據(jù)記錄：

抗體濃度：    mg/ml        加入抗體體積：    µl

標(biāo)記前抗體體積：   µl      加入NHS-PEG4-Biotin體積：    µl

純化柱規(guī)格：  cm ×   cm   凝膠體積：     ml

加入標(biāo)記抗體體積：   µl        

洗脫溶液 1ml/管收集，到核酸蛋白檢測儀顯示出峰后，改為0.5ml/管收集，并記錄數(shù)據(jù)：

附錄：

一、標(biāo)記計(jì)算：

   1、不同抗體濃度時(shí)，抗體與Sulfo-NHS-Biotin的比率：

     Sulfo-NHS-Biotin MW：589

2、10mmol/L Sulfo-NHS-Biotin 配方：

 3、標(biāo)記計(jì)算加入體積計(jì)算：

西安齊岳生物可以提供的定制材料包括有：

dUTP-biotin

Biotin-Ubiquitin

修飾的納米銀探針

化的殼聚糖Bio-CS

星形七臂官能化聚己內(nèi)酯(CDSPCABCL)

修飾的Pluronic普朗尼克

修飾二茂鐵Biotin-Fc

AP-tag標(biāo)簽的FOXM1真核表達(dá)載體

Biotin-PEG-PLLA-PLL

聚乙二醇-聚乳酸-二丙烯酸酯(PPA)共聚物

Mpeg-b-PCL-b-PPEEA聚乙二醇-聚已內(nèi)酯-聚（氨乙基乙撐磷酸酯）

PLGA-PPEEA 聚（氨乙基乙撐磷酸酯）-聚乳酸-羥基乙酸共聚物

PTMC-PEG-PTMC

修飾的冬凌草甲素脂質(zhì)體

/雙配體修飾的殼聚糖材料

FA-CS-g-PSBMA -殼聚糖-磺酸甜菜堿

乳糖修飾殼聚糖

乳糖修飾去甲素(Lac-NCTD)

去甲素殼聚糖納米粒(NCTD-CS-NPs)

Biotin偶聯(lián)乳糖

半乳糖化殼聚糖接枝聚乙烯亞胺galactosylated chitosan-g-PEI

RGD多肽偶聯(lián)殼聚糖chitosan

半乳糖修飾的巰基化殼聚糖

甘草酸表面修飾殼聚糖GA-chitosan

甲氨喋呤-乳糖酰基殼聚糖MTX-殼聚糖

甲氨蝶呤化殼聚糖納米粒MTX-Biotin-CS

修飾β2微球蛋白

修飾稀土摻雜無機(jī)熒光納米顆粒

修飾螢火蟲熒光素酶

化微細(xì)纖維肽修飾IGF-1

修飾水溶性共軛聚合物(PFPNBr-biotin)

BDNF-PEG-biotin

化乙酰普魯蘭多糖

FAM-Biotin,FITC-Biotin綠色熒光標(biāo)記

Biotin-NHS活化脂修飾

PHEMA-biotin 修飾聚(甲基丙烯酸-2-羥乙酯)

PLGA-Biotin 修飾PLGA

Biotin修飾紅細(xì)胞膜

poly(NIPAAm-co-Ada)

修飾的多肽RGD

Biotin修飾CdTe量子點(diǎn)

化修飾的聚己內(nèi)酯(PCL/Biotin)

Biotin-PEG-b-Leu

鏈霉親和素化的量子點(diǎn)(streptavidin-QDs)

Prazosin-PEG2000-biotin

(Biotin)表面功能化修飾多壁碳納米管

Biotin-PEG-PLL-peptide-DOX

PLL-PEG-Biotin

Biotin-PEG-c(RGDyK)

biotin-HWTX-Ⅰ標(biāo)記蛛素虎紋捕鳥蛛素-Ⅰ

ssDNA-Biotin-SA-AuNPs復(fù)合物

標(biāo)記的透明質(zhì)酸(HA-biotin

PAH-Biotin修飾半

Biotin-Ebselen小分子探針

偶聯(lián)四氨基卟啉

膽堿磷酰化偶聯(lián)殼聚糖

Chol-Dex-Biotin 偶聯(lián)葡聚糖修飾

DOTA-Biotin偶環(huán)配體造影

藻膽蛋白標(biāo)記Phycobiliprotein-Biotin

藻膽蛋白-鏈霉親和素(Streptavidin-phycobiliprotein)

偶聯(lián)物OVA-ZEN-biotin

(Biotin)偶聯(lián)的多肽zs6

Biotin-DNA偶聯(lián)物

雞卵清白蛋白偶聯(lián)(Biotin-OVA)

輔酶A-(Coenzyme A-biotin)

FITC標(biāo)記的轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf-FITC)

(biotin)修飾的ddNTP核苷酸

活化的轉(zhuǎn)鐵蛋白(Biotin-Tf)

HEMA-biotin-Lys-CD

蛤蚌素-偶聯(lián)物

姜黃素-偶聯(lián)物

多肽CRGD修飾紅細(xì)胞膜

偶聯(lián)膽甾醇化乙二醇?xì)ぞ厶?/span>

-葡聚糖聚醛偶聯(lián)物(Chol-Dex-CHO)

BIO修飾阿霉素DOX-biotin

修飾科研BIOTIN-Drud

CY3/CY5/CY5.5-Biotin修飾熒光染料

溫馨提示：西安齊岳生物科技有限公司供應(yīng)的產(chǎn)品用于科研，不能用于人體、科研研究、和其他商業(yè)用途，如有購買方或方采購我公司的產(chǎn)品用于、科研研究或商業(yè)用途，購買方或方將承擔(dān)法律責(zé)任，我公司也將追究其法律責(zé)任以上產(chǎn)品均可定購