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上海研晶生化試劑有限公司


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Ultrasense® ECL化學發光底物試劑盒使用說明書

閱讀：2809發布時間：2011-09-21

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產 品
名   稱
規 格
試劑A
發光劑/增強劑溶液
25ml
試劑B
過氧化物緩沖液
25ml

組成：
 
產品簡介：ECL化學發光底物是免疫印跡實驗中與辣根過氧化物酶（HRP）配套使用的高靈敏度檢測試劑。本品在HRP的催化下發生化學發光反應，用于檢測固定在PVCF膜上的蛋白質、DNA等生物大分子，能夠檢測到10-15g水平的抗原；發出的光強度強烈而持久，可以用照相技術（X-光膠片曝光）、凝膠成像儀等方法顯示、檢測。
保存條件： -4℃避光保存，保質期二年。
操作步驟：
1. 按照常規細胞破膜、提取蛋白、電泳、轉膜、HRP標記抗體或核酸探針孵育后，充分洗滌印跡膜。
2. 根據需要量，新鮮配制發光工作液：取等體積的A 溶液B溶液混合均勻，立即使用。
3. 從洗滌液中取出印跡膜，在濾紙上瀝凈洗滌液。將膜浸入發光工作液中，并與之充分接觸。室溫孵育 2—5分鐘。
4. 從發光液中取出印跡膜，用濾紙瀝去多余的發光工作液。
5. 在 X-光膠片暗盒內面鋪一張面積大于印跡膜的塑料保鮮膜。將雜交膜緊貼保鮮膜，去除氣泡和皺褶。
6. 在暗室內將印跡膜壓在X-光膠片上，曝光不同的時間，如數秒到數十分鐘。顯影沖洗。
注意事項：
1. 為獲得*實驗結果，請務必優化實驗條件，包括檢測樣品的用量、一抗、二抗稀釋度以及雜交膜及封閉試劑的選擇；建議一抗的工作濃度為50ng/ml—1μg/ml，二抗為5ng/ml—50ng g/ml。
2.由于牛奶中含有內源性*，在使用親和素/*系統時，封閉液中請避免使用奶粉；
3.在封閉緩沖液及所有抗體稀釋液中加入高質量的吐溫-20 （終濃度為0.05 ％），以減
少非特異性結合；
4.由于疊氮鈉是HRP抑制劑，在緩沖液中避免使用疊氮鈉作為防腐劑；
5.整個免疫印跡實驗過程請確保印跡膜始終處于濕潤狀態，避免干燥；
6.為獲得*實驗效果，抗體孵育及膜洗滌步驟中請使用搖床輔助完成；
7.避光條件下，配制好的化學發光工作液在室溫下可穩定8小時。陽光或其他強光會影響工作液的效果。為獲得*效果，可于棕色瓶中配制工作液。正常實驗室燈光短時間照射不影響工作液的使用。
8.蛋白過量或長時間曝光，將加深背景并使條帶強弱變化而失去線性關系。曝光不足則使條帶模糊。
9.發光工作液孵育約3分鐘后膜上的條帶發光。高豐度蛋白條帶發光較強，在暗房中肉眼可見。低豐度蛋白條帶發光較弱，肉眼不可見，但可使X光膠片曝光。因而不能以肉眼觀察結果判斷發光時間。有時候弱帶需要曝光1—10小時。如果曝光后條帶不佳，可用洗膜緩沖液洗膜，重新孵育二抗，重新ECL發光和曝光。
10. 某些市售保鮮膜包裹印跡膜時會使熒光淬滅，應選擇高質量保鮮膜。
 可能出現的問題及解決方法：

問題
可能原因
解決方法
膠片反相（白色條帶，黑色背景）
 
 
系統中HRP過量
 
 
稀釋HRP標記物至少10倍以上
膜上出現棕色或黃色條帶
暗室中看到強烈發光
發光信號持續時間過短
 
 
信號較弱或者無信號
發光反應系統中HRP過多，消耗底物過快，引起信號迅速降低
稀釋HRP標記物至少10倍以上
抗原/抗體量不夠
增加抗原/抗體使用量
蛋白轉移率低
優化轉移系統
 
 
 
高背景
系統中HRP過量
稀釋HRP標記物至少10倍以上
封閉不足
優化封閉程序
封閉試劑選擇不當
選擇另一種封閉試劑
沖洗不充分
增加沖洗時間，次數
曝光過度
減少曝光時間
抗原/抗體濃度過高
降低抗原/抗體使用濃度
 
蛋白條帶為點狀
蛋白轉移失敗
優化轉移過程
膜未平衡
按照說明書處理膜
X-光膠片與膜之間有氣泡
曝光前去除所有氣泡
出現非特異條帶（信號維持時間較短，高背景）
系統中HRP過多
稀釋HRP標記物
出現非特異條帶（信號維持時間正常，背景干凈）
一抗用量過多
進一步稀釋一抗
SDS導致非特異結合
在實驗過程中避免使用SDS

 

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