本試劑盒僅供研究使用
預(yù)期應(yīng)用
ELISA法定量測定人血清、血漿、細胞培養(yǎng)物上清或其它相關(guān)液體中黑色素細胞抗體含量。
實驗原理
本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心酶標(biāo)免疫分析法測定標(biāo)本中黑色素細胞抗體水平。用純化的抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入黑色素細胞抗體抗原、生物素化的抗人黑色素細胞抗體的抗體、HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的。顏色的深淺和樣品中的黑色素細胞抗體呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。
試劑盒組成及試劑配制
1. 酶聯(lián)板：一塊（96孔）
2. 標(biāo)3. 準(zhǔn)品（凍干品）：2瓶，4. 每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，5. 蓋好后靜置10分鐘以上，6. 然后反復(fù)7. 顛倒/搓動以助溶解，8. 其濃度為100 ng/mL，9. 做系列倍10. 比稀釋后，11. 分別稀釋成100 ng/mL，12. 50 ng/mL ，13. 25 ng/mL，14. 12.5 ng/mL，15. 6.25 ng/mL，16. 3.12 ng/mL，17. 1.56 ng/mL，18. 其原液直接作為zui高標(biāo)19. 準(zhǔn)濃度，20. 樣品稀釋液直接作為標(biāo)21. 準(zhǔn)濃度0 ng/mL，22. 臨用前15分鐘內(nèi)配制。
如配制50ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5ml 100ng/mL的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
23. 樣品稀釋液：1×20ml/瓶。
24. 檢測稀釋液A：1×10ml/瓶。
25. 檢測稀釋液B：1×10ml/瓶。
26. 檢測溶液A：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液A 1：100稀釋，27. 稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100ul），28. 實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如1ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配制，29. 輕輕混勻，30. 在使用前一小時內(nèi)配制。
31. 檢測溶液B：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液B1：100稀釋。稀釋方法同32. 檢測溶液A。
33. 底物溶液：1×10ml/瓶。
34. 濃洗滌液：1×30ml/瓶，35. 使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍36. 。
37. 終止液：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。
標(biāo)本的采集及保存
1．細胞培養(yǎng)物上清：請離心后收集上清，并將標(biāo)本保存于-20℃，且應(yīng)避免反復(fù)凍融。
2．血清：標(biāo)本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)?biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
3．血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或?qū)?biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
注：標(biāo)本溶血會影響zui后檢測結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進行此項檢測。
操作步驟
各試劑在使用前平衡至室溫。
1. 加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)2. 準(zhǔn)孔、待測樣品孔。除空白孔外，3. 余孔分別加標(biāo)4. 準(zhǔn)溶液或待測樣品100ul，5. 注意不6. 要有氣泡，7. 輕輕混勻，8. 酶標(biāo)9. 板加上蓋，10. 37℃反應(yīng)120分鐘。
11. 棄去液體，12. 甩干，13. 不14. 用洗滌。
15. 每孔加檢測溶液A工作液 100ul，16. 37℃,60分鐘。洗板3次，17. 350ul/每孔，18. 甩干。
19. 每孔加檢測溶液B工作液 100ul，20. 37℃，21. 60分鐘，22. 洗板5次，23. 甩干。
24. 依序每孔加底物溶液90ul，25. 37℃避光顯色30分鐘（此時肉眼可見標(biāo)26. 準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，27. 后3-4孔梯度不28. 明顯）。
29. 依序每孔加終止溶液50ul，30. 終止反應(yīng)（此時蘭色立轉(zhuǎn)）。用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。
注：
1． 每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2NH2SO4。測量時先用此孔調(diào)OD值至零。
2．為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)。
洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘，根據(jù)需要，重復(fù)此過程數(shù)次。
自動洗板：如果有自動洗板機，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中。
特異性
本試劑盒可同時檢測重組或天然的人黑色素細胞抗體，且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。
計算
以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)），OD值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)），在半對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。
注意事項
1． 洗滌過程非常重要，2． 不3． 充分的洗滌易造成假陽性。
4． 一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi)，5． 如標(biāo)6． 本數(shù)量多，7． 推薦使用排槍加樣。
8． 請每次測定的同9． 時做標(biāo)10． 準(zhǔn)曲線，11． 做復(fù)12． 孔。
13． 如標(biāo)14． 本中待測物質(zhì)含量過高，15． 請先稀釋后再測定，16． 計算時請zui后乘以稀釋倍17． 數(shù)。
5．在配制標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液工作液時，請以相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。
6．底物請避光保存。
檢測范圍：
1.56 ng/mL -100 ng/mL
說明
1．試劑盒保存：-20℃（較長時間不用時）；2-8℃（頻繁使用時）。
2．有效期：6個月
3．濃洗滌液會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。
4．剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象，不會對實驗結(jié)果造成任何影響。
5．中、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準(zhǔn)。