人類基因組計劃與美國塞萊拉遺傳信息公司于 2001 年在美國《科學》雜志和英國《自然》雜志聯合宣布，他們繪制出了準確、清晰、完整的人類基因組圖譜，至此，人類基因組計劃已基本完成，隨著后基因組時代的到來，蛋白質組學得到了的發展，蛋白質組研究旨在揭示基因表達的真正執行生命活動的全部蛋白質的表達規律和生物功能。包括蛋白質組、蛋白質組學、功能蛋白質組學和結構基因組學等新的概念的提出，蛋白質組學已成為當今生物領域中極其活躍的學科。其中雙向電泳 （Two Dimensional Electrophoresis ， 2DE） 是蛋白質組研究的三大關鍵核心技術之一 （ 另兩種是質譜技術和蛋白質組信息學 ） 。由于雙向電泳技術在蛋白質組與醫學研究中所處的重要位置，它可用于蛋白質轉錄及轉錄后修飾研究，蛋白質組的比較和蛋白質間的相互作用，細胞分化凋亡研究，致病機制及耐藥機制的研究，療效監測，新藥開發，癌癥研究，蛋白純度檢查，小量蛋白純化，新替代疫苗的研制等許多方面。

　　雙向電泳由于具有高分辨率和高靈敏度已成為分析復雜蛋白混合物的基本工具。自 1975 年， O ' Farrel 等建立這種技術后，已有許多改進，使得這一技術日趨完善， 2DE 的*向電泳是等電聚焦電泳 （Iso-Electric Focusing ， IEF） ，然后通過十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳 （SDS-PAGE） 對蛋白質進行第二向電泳；在 IEF 中，蛋白質因等電點不同而被分離，在 SDS-PAGE 中，不同分子量的蛋白質相互間被分離開，再用考馬斯亮蘭或銀染進行檢測，經 Pdquest 等軟件對結果進行比對、解析。由于蛋白質的等電點和分子量是兩個彼此不相關的重要性質，而 2DE 同時利用了蛋白質間的這兩個性質上的差異分離蛋白質，因此 2DE 的分離能力非常強大，它甚至能將細胞中的 5000 種蛋白分離開， 2DE 在分離蛋白混合樣品，比較差異方面有不可替代的作用，結合質譜鑒定技術可查明大型蛋白復合物各組組分，與其它生物技術如分子生物學、分子遺傳工程、免疫學、微量蛋白質的自動氨基酸序列分析相結合，可以快速準確地發現和鑒定新的蛋白質

1. 雙向電泳技術應用過程中的關鍵步驟

a. 樣品制備 （ 蛋白提取 ）

（1） 細胞培養、處理和收集；

（2） 將細胞在 IEF 裂解緩沖液中溶解；

（3） 將樣品離心以去除不溶的細胞碎片和 DNA ，提取上清， -80 ℃保存。

b. 蛋白質定量和上樣

（1） 固相 PH 梯度干膠條 （Immobi-line PH Gradient ， IPG） 水化、等電聚焦；

（2）IPG 的平衡；

（3）SDS-PAGE ；

（4） 蛋白質檢測：考馬斯亮蘭染色或銀染色。

c. 圖像分析及數據處理

　　將染色后的凝膠放在 GS-710 光密度掃描儀上，掃描后的圖像用 PDQUEST 2D 軟件分析，選擇部分匹配的蛋白質斑點進行比較。

2. IPG 的優點

a.PH 梯度穩定、聚焦準確、精度高；

b. 無陰極漂移、堿性蛋白丟失的現象；

c. 蛋白上樣量大，可提高低含量成分的分辨效果；

d. 樣品中的鹽的干擾少，無邊緣效應；

e.PH 梯度、分離結果重現性好。

3. 在雙向電泳應用中所面臨的問題

　　許多疏水性蛋白質 （ 如膜蛋白 ） 不溶于樣品緩沖液，分子量過大 （>200kD （ 千道爾頓 ）） 酸性或堿性蛋白在電泳過程中易丟失， 2DE 不能分辨。低含量組分易被高含量組分遮蔽，降低分辨率。蛋白在提取和消化過程中的丟失、凝膠的污染、在不影響分辨率情況下的上樣量等等。

4. 雙向電泳在醫學研究中的應用

a. 人類疾病的蛋白質組研究

（1） 直腸癌：直腸癌的發生是一個多基因突變導致抑癌基因失活，癌基因活化的過程。 Sanchez 等對 15 例結腸癌和 13 例正常人的結腸上皮進行 2DE ，結果發現在分子量為 13kD 和 PI（ 增殖指數 ） 值為 5.6 處的蛋白質僅出現在結腸癌的組織中。其中 15 例患者的癌細胞中有 13 例 13kD/PI5.6 蛋白有上調趨勢 （87%） 。此外，發現此種蛋白不僅在中度、低度分化的結腸癌及有 24 年病史的潰瘍性結腸炎過度表達，而且出現在 7 例分化程度不同的腺瘤的癌前病灶，但對照組則很少出現，這表明該蛋白的出現對檢測早期直腸癌有重要的臨床意義。

（2） 肝癌： Peter 等在用 N- 甲基 -N- 亞硝基脲誘導的小鼠肝癌中，用 2DE 及氨基酸微型測序可分辨出肝癌誘導的醛糖還原酶樣的蛋白質 （35kD/PI7.4） ，此種蛋白質在肝癌、胎肝中有高表達。經免疫組化證實，肝癌誘導的醛糖還原酶樣的蛋白質在成人肝臟中不表達，但在小鼠的肝癌中又重新表達，同時發現該蛋白在癌前病變及肝癌中表達強烈，而在肝臟周圍的正常組織不表達，表明該蛋白可能與肝癌的發病有很大關系。

（3） 膀胱癌：丹麥的一個小組利用 2DE ，并結合了蛋白印跡法、微型序列分析及質譜技術分析了 150 例膀胱癌病人的組織，發現角蛋白 10 、 14 及銀屑病相關的脂肪酸結合蛋白等可作為膀胱癌不同分化程度的標記物。

（4） 腎癌： Sarto 在對腎癌的研究中發現有 4 種蛋白質存在于正常腎組織而在腎癌細胞中缺失，其中兩種分別是輔酶 Q 蛋白色素還原酶和線粒體泛醌氧化—還原復合物 I ，這提示線粒體功能低下可能在腫瘤發生過程中起重要作用。

（5） 擴張型心肌病：擴張型心肌是一種嚴重的可導致心衰的心臟病，其發病機理尚不明確，推測可能為多種因素所致， Knecht 等采用 2DE 取得了 3300 個心肌蛋白條帶，通過氨基酸序列分析， Edman 降解法及基質輔助的激光解吸離子化質譜 （MALDI-MS） 等分析了其中 150 條，經活檢及病理證實，有 12 條為擴張型心肌病*的蛋白。

（6）RA 和 OA ：類風濕關節炎 （RA） 是一種常見的慢性炎性關節疾病，本病侵犯多個關節，主要累及手足小關節，病情遷延反復，主要的病理變化為關節滑膜的慢性炎癥，細胞侵潤，血管翳形成，軟骨及骨組織侵蝕，導致關節結構的破壞，功能喪失。而骨性關節炎 （OA） 其基本病理改變為多種致病因素引起的進行性關節軟骨變性，破壞及喪失，關節軟骨及軟骨下骨邊緣骨贅形成，由此引起一系列的關節癥狀和體征。有研究者對滑膜細胞進行原代培養，應用流式細胞儀鑒定滑膜細胞類型，提取蛋白進行雙向電泳分離，比較 RA 與 OA 成纖維樣滑膜細胞 （Fibroblast-Like Syno-viocytes ， FLS） 蛋白酪氨酸磷酸化狀態的差異，結果顯示： RAFLS 蛋白酪氨酸磷酸化較 OAFLS 明顯增多，其中以相對分子質量 42 × 10 3 ~95 × 10 3 間蛋白酪氨酸磷酸化位點居多，對其結果進行灰度掃描， RAFLS 灰度掃描值為 4227672 ± 8947 ， OAFLS 為 663480 ± 7962 ， RAFLS 的灰度掃描值約為 OAFLS 的 6.5 倍，兩者具有非常顯著性差異 （T= 2.820 ， P<0.01） 。 1980 年 Hunter 首先發現酪氨酸激酶 （PTK） ，許多生長因子受體都具有 PTK 活性，一半以上的癌基因產物也具有 PTK 活性，他發現酪氨酸磷酸化比例雖小，但卻與細胞生長、增殖關系密切，很可能是正常細胞與腫瘤細胞相互轉化的關鍵，癌基因活化后， PTK 活性大大增加。 1992 年， Williams 等研究發現， RA 滑膜細胞中的 PTK 活性遠遠高于 OA ，這可能是導致 RA 滑膜細胞轉化特性而呈持續活化狀態的關鍵，作者推測 RAFLS 可能存在原癌基因的活化或突變，或多種生長因子受體的持續激活，從而導致轉化細胞的外觀表現并伴有 PTK 活性的增高。

（7） 其它：目前許多研究者利用 2DE 對人體的各種組織、器官、細胞進行了研究，為疾病的診治及了解發病機制提供了新的手段。如 Bobring 等聯合雙向電泳與 Western 技術鑒定分離了高純度精子膜蛋白，發現 14 種膜抗原。它們極有可能與男性不孕癥或輸精管切除患者體內抗精子自身抗體 SPAb 結合，影響精子運動與頂體反應，為深入了解精子不育機理，確定 SPAb 的存在找到一個可行的方法。有作者在酒精對人體毒性的研究中發現，乙醇會改變血清蛋白糖基化作用，導致許多蛋白的糖基缺乏，如轉鐵蛋白。

b. 致病微生物的蛋白質組研究

（1） 檢測博氏疏螺旋體與免疫相關的蛋白質：博氏疏螺旋體是萊姆病的主要原因，約有 50% 的未治患者發展為神經系統及關節系統疾病，該螺旋體分為三種類型： B.burgdorferi sensu stricto ； B.garinii ； B.afzelii 。其診斷由于血清學檢查的局限性而存在敏感性及特異性變化大的缺點，為克服這一不足， Peter 等用 2DE 從 B.garinii 得到 217 個銀染的蛋白斑點，從中用兔多克隆抗體鑒別出 6 個已知抗原，將不同臨床表現萊姆病患者的血漿用 B.garinii 2DE 圖雜交。用抗 IgM 及抗 IgG 作為第二抗體，在 10 例有游走性紅斑的患者血漿中，檢測出 60~80 個抗原，同時發現在有關節炎患者血漿中，包含有抗 15 種抗原的 IgM 抗體及抗 76 種不同抗原的 IgG 抗體。而晚期有神經系統癥狀的患者血漿中，則包含有抗 33 種抗原的 IgM 抗體及抗 76 種抗原的 IgG 抗體。上述三種類型患者的血漿中均包含有抗 6 種已知抗原的抗體，且被 SDS-PAGE 雜交所證實，這些抗原均為特異性診斷的標志物。

（2） 弓形體抗原的檢測：弓形體病是由鼠弓形體蟲引起的寄生蟲病，如果懷孕的婦女在妊娠期受到感染，該蟲可通過胎盤引起胎兒的感染，大約 50% 新生兒由于母體的感染而引起先天性疾病。目前一般利用血清學及 PCR ，而單獨采用血清學如用 IgG 、 IgM 或 IgA 抗體對疾病活動期敏感性不夠，尤其對于妊娠或有免疫抑制的患者，因此臨床上能否作到早期診斷，而使患者得到早期治療尤為重要。 Jungblut 等將鼠弓形體蟲 RH 株在人羊膜細胞系 FL521 中傳達后，用 2DE 得到 300 個銀染斑點，再將其與以下三種患者的血漿進行免疫雜交：

（a） 患有急性弓形體病的妊娠婦女 （N=11） ；

（b） 患急性弓形體病的非妊娠 （N= 6） ；

（c） 有潛在感染的患者 （N=9） 。

　　結果有 9 個斑點對各階段的弓形體感染均反應，這 9 種斑點被用來當作弓形體感染的標記，其中 7 種標記可用作區別疾病的不同階段。

（3） 新抗生素作用機理的研究：在新抗生素作用機理的研究方面， 2DE 技術發揮了重要作用，因現在細菌對大多數抗生素都有了抗藥性，而用于臨床的抗生素幾乎都是原有抗生素的衍生物，而目前這種狀態有所改變，在研究抑制核糖體類抗生素對細菌的作用機制時，對 12 種作用于翻譯過程的不同階段和核糖體內不同分子的抗生素加以考察，發現其中 8 種誘導冷休克反應的一系列蛋白質，另 4 種誘導一系列熱休克反應的蛋白質，因此預計新的作用于核糖體的化合物也是誘導這兩種反應，并且藉此可推測大腸桿菌對冷熱的反應發生于核糖體水平上。

　　由此可見雙向電泳技術在蛋白質組與醫學研究中所處的重要位置，它在分離蛋白質譜的應用引起了蛋白質生化和功能分析方法的復興。我們相信隨著蛋白質組研究的技術體系的不斷改進和發展，為人類從蛋白質水平上揭開生命活動規律的那一天終究會早日到來。

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