實驗試劑
DMEM培養基
胎牛血清
PBS
BD24孔細胞培養板
Raininpipettips,1ml
戊二醛
乙醇
結晶紫
細胞培養儀：37°Cand5%CO2
人MDA-MB-231cell
1. 細胞在含有10%FBS的DMEM培養基中生長。
2. 細胞以一定密度接種到24孔細胞培養板中，生長24小時后，單層細胞融合度應達到70-80%。
3. 不要更換培養基。用新的1ml槍頭輕輕的在單層培養細胞間劃痕，劃痕橫穿過孔，槍頭盡量與板孔的底部垂直，不要傾斜。這樣產生的gap的距離才與槍頭末端的外直徑相等。Gap的距離可以選用不同型號的槍頭調節。劃痕在同一方向成一條直線。
4. 在垂直與*條劃痕的方向制作另一條劃痕，每孔劃痕成十字交叉型。
5. 劃痕后，用培養基輕輕的清洗板孔2次，以去除脫落細胞。
6. 每孔添加新鮮培養基。
7. （培養基中含有某些成分，如抑制/促進細胞遷移和/或增殖的化學物質）。
8. 細胞生長48小時（或根據時間需要）。
9. 1xPBS清洗細胞兩次，然后使用3.7%多聚甲醛固定30分鐘。
10. 0.1%的結晶紫（2%乙醇溶解）染色30分鐘。
11. 染色的單層細胞選取不同的視野，顯微鏡拍照。gap的距離可通過Photoshop或ImagJ軟件測量.為了降低實驗結果的可變性，建議每孔選擇多個視野觀察，每組做多個重復。
?孔??pˊ????后15分鐘內，用450nm波長測量各孔的吸光值（OD值）。
12. 計算：根據標準品的濃度及對應的OD值，計算出標準曲線的直線回歸方程，再根據樣本的OD值，在回歸方程上計算出對應的樣品濃度，也可以使用各種應用軟件來計算。zui終濃度為實際測定濃度乘以稀釋倍數。
1. 樣本不能含疊氮鈉（NaN3），因為疊氮鈉（NaN3）是辣根過氧化物酶（HRP）的抑制劑。
2. 標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能立即試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融。
3. 樣本應充分離心，不得有溶血及顆粒。
4. 實驗嚴格按照說明書的操作進行，實驗結果判定必須以酶標儀讀數為準。
5. 酶標包被板開封后如未用完，應立即裝入密封袋中加干燥劑保存。
6. 建議所有的標準品、樣本和空白對照都做雙份檢測，取平均值，以減小實驗誤差。
7. 牢記樣本已經稀釋5倍，計算結果乘以5才是樣本實際濃度。
8. 本試劑盒定量范圍為20-640ng/L，超過此范圍，為標準曲線延伸計算所得，不做為準確定量結果，請用特殊稀釋液稀釋后測定準確結果（20-640ng/L范圍內），乘以總稀釋倍數即為樣本zui終濃度。
9. 若顯色過淺，可適當延長底物溫育時間。
10. 為避免交叉污染，標準品、樣本和空白對照每加一個就要更換一次吸頭；酶標工作液、*和底物等公共組分，要懸臂加樣，不得碰到微孔；不得重復使用封板膜。
11. 試劑盒保質期內使用，不同批號的試劑不得混用。
12. 底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。
