名稱：小鼠肝癌細胞瘤
目的 ：
1BBL基因的小鼠肝癌細胞瘤苗體外刺激同系小鼠脾細胞產生細胞因子（IL2、TNFα和GMCSF）的能力。
（一）1BBL基因的小鼠肝癌細胞瘤苗的研究材料及方法：
1.材料 ：
小鼠肝癌細胞株Hepa16由上海第二軍醫大學合作腫瘤研究所郭亞軍教授惠贈，轉m41BBL基因的高表達細胞株Hepa16m41BBL及轉空載體的Hepa16neo為作者建立［3］，DMEM培養基為Gibco公司產品，新生牛血清為杭州四季青公司產品。大鼠抗小鼠41BBL抗體（BD公司產品）購自深圳晶美公司，羊抗大鼠IgGFITC、PHAP、MTT、DMSO為Sigma公司產品。絲裂霉素C（MMC）為 Kyowa Hakko Kkgyo 公司產品。TRIzol試劑及superscript Ⅱ反轉錄試劑盒為Invitrogen公司產品。Taq酶為華美公司產品。C57BL/6小鼠購自第四軍醫大學實驗動物中心，6周齡，雌性。淋巴細胞分離液購自TBD生物技術發展中心。放線菌素Ｄ（ACD）為Fluka公司產品。IL2標準品、TNFα標準品、GMCSF標準品為第四軍醫大學生物技術中心及免疫教研室提供。L929細胞株、TF1細胞株為第四軍醫大學免疫教研室提供。引物由上海生工生物工程公司合成，根據GeneBank中m41BBL基因全長序列設計上游引物P1：5’GCGGATCCATGGACCAGCACACACTTGA3，下游引物P2：5’CGGATTCTCATTCCCATGGGTTGTCGG3’。預計擴增片段長度為945bp。
2.方法：
（1）C57BL/6小鼠脾細胞懸液制備及混合淋巴細胞培養
無菌取C57BL/6小鼠脾臟，無菌玻璃針芯研磨并過150目篩網，制備單細胞懸液， RPMI1640洗滌一次，以含10%新生牛血清的RPMI1640重懸細胞，調整細胞濃度為1×107/ml，置 12孔培養板，分別加入培養液，TCVHepa16，TCVHepa16neo，TCVm41BBL，細胞濃度為 5×105 /ml（脾細胞與TCV比例20∶1），37℃、50%CO2 培養36ｈ，離心收集培養上清，用于檢測細胞因子。
（2） 腫瘤細胞疫苗的制備
收集培養的Hepa16、Hepa16neo及Hepa16m41BBL細胞，1×PBS液洗2次，細胞數調至1×1010/L，用MMC（80mg/L）于37℃、50%CO2處理1h，1×PBS液洗3次，重懸細胞，制成腫瘤細胞疫苗備用 （分別稱為TCVHepa16、TCVHepa16neo、TCVm41BBL）。
（3） MMC處理前后轉染細胞m41BBL表達的變化
取對數生長期的Hepa16m41BBL細胞穩定表達克隆，以1×105 /孔的濃度鋪6孔板，培養48h后，1×PBS洗2次，用MMC（80mg/L）于37℃、50% CO2處理1h，1×PBS洗3次，重新加*培養液培養，分別于作用前、作用后6h、24h、48h收集細胞提取總RNA，用于RTPCR檢測。
（4） GMCSF的測定方法
采用GMCSF依賴的TF1細胞株作為靶細胞的MTT法 [4]。用含10%小牛血清、GMCSF 60U/ml的RPMI1640培養液培養TF1細胞，檢測時收集細胞懸液，PBS洗滌 3次，調細胞濃度為1×105/ml。取100μl的待測樣品及稀釋GMCSF標準品（濃度為200U/ml），于96孔培養板內作倍比稀釋，設3個復孔及陰性對照（培養液）組，每孔另加入上述細胞懸液各100μl，37℃、50%CO2 培養 24h，或觀察至陰性對照組細胞全部死亡時，MTT法檢測。于96孔培養板中每孔加入MTT 20μl，37℃、50% CO2培養4～6h，離心1000 r/min，5min，吸棄上清，每孔加入DMSO200μl，充分吹打混勻或過夜 ，于酶標分析儀上測定570nm的吸光度（Ａ）值。
計算公式：GMCSF活性單位=（樣品達50 %標準品zui大Ａ值稀釋度/標準品50 %zui大Ａ值稀釋度）×標準品單位
（5） 統計學方法
結果以SPSS10.0統計軟件行方差分析，P<0.05為相差顯著。
（6） TNFα的測定方法
采用對小鼠L929細胞的細胞毒效應的MTT檢測法 [4]。檢測時收集細胞懸液，PBS洗滌3次，調細胞濃度為2×105/ml。于96孔板內每孔100μl、37℃、50% CO2培養24h，棄上清。取100μl的待測樣品及稀釋TNFα標準品（濃度為100U/ml），于96孔培養板內作倍比稀釋，設3個復孔及陰性對照（培養液）組，每孔另加入放線菌素Ｄ 10μl，37℃、50%CO2培養12～14h，或觀察至陰性對照組細胞全部死亡時，于每孔加入MTT 10μl，37℃、50%CO2培養4～6h，吸棄上清，每孔加入DMSO 100μl，震蕩后在酶標分析儀上測定570nm的Ａ值
計算公式：TNFα活性單位=（導致50 %細胞死亡的TNFα標準品zui大稀釋度/導致50 %細胞死亡的TNFα樣品zui大稀釋度）×標準品單位
3.結果
（1） MMC作用前后腫瘤細胞表達m41BBL的變化
經RTPCR檢測顯示Hepa16m41BBL細胞經MMC作用后于48h仍能表達m41BBL,見圖1。
（2） 腫瘤細胞疫苗對脾細胞產生細胞因子的影響
將野生型的Hepa16、Hepa16neo及轉基因的Hepa16m41BBL細胞經絲裂霉素C作用后與同系的C57BL/6小鼠脾細胞共同培養，36h后取培養上清用于檢測相關細胞因子，結果顯示轉41BBL基因的瘤苗體外刺激脾細胞產生的IL2、TNFα及GMCSF水平均上升。統計分析表明，與野生型的Hepa16瘤苗有顯著差異（P<0.05）。
討論
為了研究41BBL在抗肝癌免疫中的應用價值，我們將41BBL基因導入已知不表達41BBL的小鼠肝癌細胞Hepa16中并制成腫瘤疫苗，為了保證所需的腫瘤細胞疫苗能保持其高免疫原性及低致瘤性，我們在實驗中采用了合適劑量的絲裂霉素C處理腫瘤細胞，結果顯示，絲裂霉素C處理后48h腫瘤細胞仍能表達41BBL，并且在培養瓶中部分細胞能保持貼壁一周左右，將此瘤苗接種小鼠后不能成瘤。
41BBL為腫瘤壞死因子超家族成員，屬于胞膜表面的Ⅱ型糖蛋白，主要表達于活化的抗原提呈細胞如B細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞表面，部分的腫瘤細胞也能表達41BBL [5]。41BBL與其受體41BB作用后可以調節多種免疫細胞的功能，可以有力地共刺激T細胞，使其增殖，增加它們的溶細胞能力。
以往認為41BBL在體內優先誘導CD8+T細胞的活化 , 但是，zui近Cannons JL等人卻報道了41BBL刺激后，CD4+T和CD8+T細胞在發生細胞分裂、維持存活及增強效應功能等方面并無明顯區別 [8]。CD8是殺傷性T淋巴細胞表面標志物。CD4是TH細胞表面標志物。目前認為，腫瘤免疫主要激活MHCI類分子限制的CD8+ T淋巴細胞，同時MHCII類分子限制的CD4+ T細胞的活化對維持CTL的殺傷活性和免疫記憶都具有十分重要的意義。CD4+的TH1細胞能產生IL2、IFNγ、TNFα和GMCSF等細胞因子。我們在先前的實驗中發現m41BBL基因轉染的Hepa16細胞疫苗能較有效誘導CD8+ T淋巴細胞產生針對野生型 Hepa16細胞的特異性殺傷活性。本研究結果顯示，將TCV41BBL體外與脾淋巴細胞共培養，其上清中IL2、TNFα和GMCSF水平明顯上升，這也說明41BBL不但能刺激誘導CD8+ T細胞的活化，同時也能激活CD4+T細胞產生細胞因子，通過這些細胞因子間接激活CD8+細胞可能是其抗腫瘤機制之一。
