AAT 是一個(gè)多功能蛋白大家族，主要負(fù)責(zé)催化生物體內(nèi)各種酰基化和去酰基化反應(yīng)，在基因表達(dá)、代謝和信號傳導(dǎo)中具有重要作用。

測定原理：

AAT 催化乙酰 CoA 轉(zhuǎn)移乙酰基到丁醇，釋放的CoA 還原 DTNB 生成 TNB；TNB 在 412nm 有吸收峰，測定 412nm 吸光度增加速率可計(jì)算 AAT 活性。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：

研缽、冰、臺式離心機(jī)、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔板、恒溫水浴鍋。

試劑組成和配制：

試劑一：液體 100 mL×1 瓶，4℃保存。試劑二：液體 15 mL×1 瓶，4℃保存。

試劑三：粉劑×1 管，-20℃保存。臨用前加蒸餾水 1mL 充分溶解，4℃保存。試劑四：液體 2 mL×1 管，4℃保存。

試劑五：粉劑×1 管，4℃避光保存。臨用前加入試劑二 1mL 充分溶解，4℃避光保存。

粗酶液提取：

1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。12000g，4℃離心 20min，取上清置冰上待測。

2. 細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：試劑一體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500萬細(xì)胞加入 1mL 試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時(shí)間 3min）；然后 12000g，4℃，離心 20min，取上清置于冰上待測。

3. 液體：直接檢測。

酰基轉(zhuǎn)移酶（AAT）檢測試劑盒AAT 測定操作：

1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min，調(diào)節(jié)波長到 412nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑二在 37℃水浴保溫 30min 以上。

3. 空白管：依次在 1mL 玻璃比色皿中依次加入 20µL 蒸餾水、140µL 預(yù)熱的試劑二、10µL 試劑三、20µL 試劑四和 10µL 試劑五，迅速混勻后于 412nm 比色，記錄 10 s 和 130 s 的吸光值，分別記為 A1 和 A2。△A 空=A2-A1。空白管只需做 1 個(gè)。

4. 測定管：依次在 1mL 玻璃比色皿中依次加入 20µL 上清液、140µL 預(yù)熱的試劑二、10µL 試劑三、20µL 試劑四和 10µL 試劑五，迅速混勻后于 412nm 比色，記錄 10 s 和 130 s 的吸光值，分別記為 A3 和 A4。△A 測=A4-A3。如果△A 測偏低，可以延長反應(yīng)時(shí)間，如測定 10 s 和 310 s 的吸光度，相應(yīng)修改計(jì)算公式中反應(yīng)時(shí)間。

 酰基轉(zhuǎn)移酶（AAT）檢測試劑盒AAT 活性計(jì)算：

a. 使用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下

（1） 按照蛋白濃度計(jì)算
活性單位定義：37℃中每毫克蛋白每分鐘催化吸光值變化 0.001 個(gè)單為 1U。AAT (U/mg prot) = 1000×（△A 測—△A 空）÷(Cpr×V 樣) ÷T
= 5000×（△A 測—△A 空）÷Cpr
（2） 按照樣本質(zhì)量計(jì)算
活性單位定義：37℃中每克組織每分鐘催化吸光值變化 0.001 個(gè)單為 1U。AAT (U/g) = 1000×（△A 測—△A 空）÷(W×V 樣÷V 樣總) ÷T
= 5000×（△A 測—△A 空）÷W
（3） 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
活性單位定義：37℃中每 104 個(gè)細(xì)胞每分鐘催化吸光值變化 0.001 個(gè)單為 1U。 AAT (U/104 cell) = 1000×（△A 測—△A 空）÷(細(xì)胞數(shù)量×V 樣÷V 樣總) ÷T
= 5000×（△A 測—△A 空）÷ 細(xì)胞數(shù)量
Cpr：上清液蛋白濃度，mg/mL，蛋白質(zhì)濃度需要另外測定；V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積， 0.1mL；W：樣本質(zhì)量，g：V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，0.1mL；V 樣總：提取液體積，
1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，2 min。
b. 使用 96 孔板測定的計(jì)算公式如下
（1） 按照蛋白濃度計(jì)算
活性單位定義：37℃中每毫克蛋白每分鐘催化吸光值變化 0.001 個(gè)單位為 1U。AAT (U/mg prot) = 1000×(△A 測—△A 空)×V 總÷(Cpr×V 樣) ÷T
= 5000×(△A 測—△A 空)÷Cpr
（2） 按照樣本質(zhì)量計(jì)算
活性單位定義：37℃中每克組織每分鐘催化吸光值變化 0.001 個(gè)單位為 1U。AAT (U/g ) = 1000×(△A 測—△A 空)×V 總÷(V 樣÷V 樣總×W) ÷T
= 5000×(△A 測—△A 空)÷W
（3） 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
活性單位定義：37℃中每 104 個(gè)細(xì)胞每分鐘催化吸光值變化 0.001 個(gè)單位為 1U。AAT (U/104 cell) = 1000×(△A 測—△A 空)÷(細(xì)胞數(shù)量×V 樣÷V 樣總) ÷T
= 5000×(△A 測—△A 空)÷ 細(xì)胞數(shù)量
Cpr：上清液蛋白濃度，mg/mL，蛋白質(zhì)濃度需要另外測定；V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積， 0.02mL；V 總：反應(yīng)總體積，0.2 mL；W：樣品質(zhì)量，g；V 樣總：提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，15min。Cpr：上清液蛋白濃度，mg/mL，蛋白質(zhì)濃度需要另外測定；V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，0.02mL；V 總：反應(yīng)總體積，0.2 mL；W：樣品質(zhì)量，g；V 樣總：提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，2min。
酰基轉(zhuǎn)移酶（AAT）檢測試劑盒注意事項(xiàng)：
1. 上清液蛋白質(zhì)含量需要另外測定。建議購買本公司生產(chǎn)的 BCA 蛋白質(zhì)含量測定試劑盒。
配制好后未使用完的試劑 4℃保存，3 天內(nèi)使用完畢。