谷氨酸合成酶（GOGAT）檢測試劑盒正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：
GOGAT 廣泛分布于植物中，和谷氨酰胺合成酶共同構(gòu)成 GS/GOGAT 循環(huán)，參與氨同化的調(diào)控。
測定原理：
GOGAT 催化谷氨酰胺的氨基轉(zhuǎn)移到α -酮戊二酸，形成兩分子的谷氨酸；同時 NADH 氧化生成 NAD+，340nm 吸光度的下降速率可以反映 GOGAT 活性大小。
自備實驗用品及儀器：
紫外分光光度計/酶標(biāo)儀、臺式離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。
試劑組成和配制：
提取液：液體 100mL×1 瓶，4℃保存； 試劑一：液體 20mL×1 瓶，4℃保存； 試劑二：粉劑×2 瓶，4℃保存；
粗酶液提?。?br />細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（104 個）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。
組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。
谷氨酸合成酶（GOGAT）檢測試劑盒測定步驟：
1、分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 340nm，蒸餾水調(diào)零。
2、樣本測定
（1） 在試劑二中加入 9mL 試劑一充分溶解混勻，置于 37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種） 水浴 5min；現(xiàn)配現(xiàn)用（配好后 3h 內(nèi)用完）；
（2） 在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 20μ L 樣本和 180μ L 試劑二，混勻，立即記錄340nm處 20s 時的吸光值A(chǔ)1 和 5min20s 后的吸光值 A2，計算 Δ A=A1-A2。
GOGAT 活性計算：
a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下
（1） 按樣本蛋白濃度計算：
單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個酶活力單位。GOGAT（nmol/min/mg prot）＝[Δ A×V 反總÷（ε  ×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=321×Δ A÷Cpr
（2） 按樣本鮮重計算：
單位的定義：每g 組織每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

GOGAT （ nmol/min/g 鮮重） ＝ [Δ A×V 反總÷ （ ε ×d ） ×109]÷(W ×V 樣÷V 樣總)
÷T=321×Δ A÷W
谷氨酸合成酶（GOGAT）檢測試劑盒（3） 按細菌或細胞密度計算：
單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。GOGAT （ nmol/min/104 cell ）＝[Δ A×V 反總÷（ ε ×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總)
÷T=0.642×Δ A
V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε ：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d： 比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.02 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500 萬。
b. 用 96 孔板測定的計算公式如下1）按樣本蛋白濃度計算：
單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個酶活力單位。GOGAT（nmol/min/mg prot）＝[Δ A×V 反總÷（ε  ×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=643×Δ A÷Cpr
（2） 按樣本鮮重計算：
單位的定義：每g 組織每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。
GOGAT （ nmol/min/g 鮮重） ＝ [Δ A×V 反總÷ （ ε ×d ） ×109]÷(W× V 樣÷V 樣總)
÷T=643×Δ A÷W
（3） 按細菌或細胞密度計算：
單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。
GOGAT （ nmol/min/104 cell ）＝ [Δ A×V 反總÷ （ ε  ×d ） ×109]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=1.286×Δ A
谷氨酸合成酶（GOGAT）檢測試劑盒V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε ：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d： 96 孔板光徑，0.5cm；V 樣：加入樣本體積，0.02 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T： 反應(yīng)時間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細菌或細胞總數(shù)， 500 萬。