NAD激酶（NADK）檢測試劑盒活性微量法說明書

測定意義：

NADK（EC 2.7.1.23）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞中，是目前所發現的生物體內惟一能夠催化 NAD+磷酸化生成 NADP+的酶，可催化 NAD(H)以 ATP 或無機多聚磷酸[poly(P)]作為磷?；w進行磷酸化反應，生成 NADP(H)。因此，NAD 激酶在合成 NADP(H)以及調節 NAD(H)與 NADP(H)的平衡上具有重要作用。

測定原理：

NADK 催化 NAD+磷酸化，生成 NADP+；NADP+可被 6-磷酸葡萄糖脫氫酶還原為 NADPH；在 340 nm 下測定 NADPH 增加速率?？煞从吵?/span> NADK 活性的大小。

自備實驗用品及儀器：

可見分光光度計/酶標儀、恒溫水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96 孔板和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：液體 100 mL×1 瓶，4℃保存； 試劑一：液體 10 mL×1 瓶，4℃保存； 試劑二：液體 25 mL×1 瓶，4℃保存； 試劑三：粉劑×1 瓶，-20 ℃保存；

試劑四：粉劑×1 瓶，-20℃保存；

樣本測定的準備：

1、細菌、細胞或組織樣品的制備：

細菌或培養細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（104 個）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）樣品：直接檢測。

NAD激酶（NADK）檢測試劑盒測定步驟：

1、分光光度計或酶標儀預熱 30min 以上，調節波長至 340nm，蒸餾水調零。

2、將試劑一和試劑二 37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）水浴 15min 以上。

3、工作液Ⅰ的配制：在試劑三中加入 5mL 試劑一，充分混勻待用；用不完的試劑分裝后-20℃ 保存，禁止反復凍融；

工作液Ⅱ的配制：在試劑四中加入 18mL 試劑二，充分混勻待用；用不完的試劑分裝后-20℃ 保存，禁止反復凍融；

4、加樣表

NADK （ nmol/min /g 鮮重） ＝ [Δ A×V 反總÷ （ ε  ×d ） ×109]÷(W× V 樣÷V 樣總)

÷T=107.18×Δ A÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘生成 1 nmol NADP 定義為一個酶活力單位。NADK （ nmol/min /104 cell ）＝[Δ A×V 反總÷（ ε ×d ）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總)

÷T=0.214×Δ A

NAD激酶（NADK）檢測試劑盒V 反總：反應體系總體積，1×10-4 L；ε ：NADPH 摩爾消光系數，6.22×103 L / mol /cm；d： 96 孔板光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.02 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，15 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數， 500 萬。