當年陰陽師大火的時候，次聽身邊的朋友說起抽 SSR，心里一驚：難道這玩意兒還能抽？后來明白，此 SSR 非彼 SSR，實驗狗說到的 SSR 是這樣的：

簡單重復序列（Simple Sequence Repeat,SSR）也被成為微衛星 DNA，根據其兩端互補序列設計引物，通過 PCR 反應擴增微衛星片段，由于核心序列的串聯重復數目不同，所以能夠用 PCR 的方法擴增出不同長度的 PCR 片段，將這些片段進行凝膠電泳，根據分離片段的的大小確定所研究生物基因的基因型，可以計算出等位基因的基因頻率。

我們的 SSR 有很多優點呀，比如在真核生物基因組中分布較為廣泛（植物中平均每 20~30 Kb 就會出現一個 SSR）、可以輕松鑒別純合子雜合子（微衛星共顯性遺傳）、所需 DNA 量較少（單位以 ng/ul 計）、成本較低等。

我們實驗室即是采用圖位克隆的方法，對模式生物——水稻進行基因定位與克隆的。

我們分離 PCR 產物用的是 8% 的丙烯酰胺凝膠電泳，一直效果不錯，新生剛來的時候，就是從學習提水稻 DNA、擴 PCR、跑 SSR PAGE 膠（俗稱「跑槽」，233333）開始進行基因的圖位克隆的。

理想的情況應該是染色洗凈后的膠面上，背景干凈、marker 清楚、親本 + 個體的每個條帶清晰明亮，不會對讀數據有任何影響的。然而這僅是理想狀態，對新進實驗室門的準研究生尤其是碩士生來說，跑出干凈明亮的條帶甚至跑出條帶，都是一件無比期盼的事。所以今天想分享一下，作為新生，SSR PAGE 膠跑不出條帶的時候，該怎么解決？

首先要做的，一定是仔細觀察染色后全部 PAGE 膠的膠面，跑不出條帶會有以下幾種情況：

1、 整個膠面「干凈無比」，什么都沒有，沒有 Marker、沒有親本、沒有個體，光潔如鏡到懷疑人生。這時候可能就需要考慮，是不是電泳槽或者膠做得有問題了：

 當出現有的膠面沒有條帶、有的膠面條帶正常顯示的時候，說明少數的電泳槽可能出現了問題，而用槽的時候剛好踩到了這幾顆雷，那就沒辦法了，按流程把沒跑出條帶的這些樣品重新擴 PCR、換電泳槽來重新跑就是了；

 當出現所有膠面全部沒有條帶的時候，可能會懷疑 PAGE 膠做的有問題。我們的 PAGE 膠的成分是：去離子水、TBE、8% 丙烯酰胺（+ 甲叉丙烯酰胺）、10% 過硫酸銨溶液（AP）和 TEMED，這個時候可能某種試劑出現了問題，比如 TBE 濃度配得太低、丙烯酰胺出了差錯，等等，需要改換合適的試劑或者自己配制（實驗室有一次公共的丙烯酰胺配錯了。坑了好一堆人，都是淚啊），重新跑膠。

2、 膠面上有清楚明亮的 Marker，但是親本 + 個體的條件都沒有出現。Marker 的出現表明電泳槽和 PAGE 做得都沒有問題，就要從擴好的 PCR 原液上找原因了：

 有的膠面有 Marker、親本 + 個體帶件正常，有的膠面只有 Marker，親本 + 個體都顯示不出來。這個時候我一般會懷疑，擴 PCR 的 PCR 儀出現了問題，一部分 PCR 儀工作正常，而那些擴不出來的樣品踩到了出了毛病的 PCR 儀的雷上，就出現了這樣的結果，OK，換好用的 PCR 儀就是了（要保證擴增程序沒問題）；

 所有的膠面都只有 Marker，一概沒有親本 + 個體的條帶，這時候我可能會想，是不是 PCR 體系中出現了錯誤。PCR 體系分兩邊來想，一個是 DNA + 引物，一個是去離子水 + Buffer+dNTP+rTaq 酶。DNA 在提好之后必然會檢測它的濃度、觀察峰值和曲線，如果都比較理想的話，一般不會有什么事（不放心可以擴個水平的瓊脂糖膠檢測一下）；

在基因的連鎖階段，引物是全實驗室通用并統一保管的，若出現了問題，肯定是大家都跑不出條帶的，如果是自己分裝的，注意看一下是不是在常溫環境放太久，引物失活了；一般去離子水不予考慮，dNTP 加足量即可（當然我們會 2-3 倍量地加進體系中，怎么會不夠呢？）；

Buffer 注意看是否加入了 Mg2+（曾經有一段時間，實驗室買的 Buffer 是需要另加 Mg2 + 的，然而大家都沒有注意到，一個大組的人在 SSR PAGE 上連跪好幾天）；

zui后是 rTaq 酶，其實這個酶的活性還是比較好的，平常 -20℃冰箱存放，拿出來用的時候打點冰放冰上就 OK 啦。

 zui后的小 Tips 是，樣品放進 PCR 儀之前，儀器的樣品孔和熱蓋溫度都是常溫的，程序設定步 95℃ 它會有一個升溫過程，這個時候別著急稍放樣品，微等一下，等 PCR 儀到了 70-80℃，再趕快把樣品放進去，蓋上蓋子。可以減少升溫過程對 rTaq 酶的損耗。

3、 膠面上有清楚明亮的 Marker，親本也清楚單一，但是個體的條件沒有出現，整個 PAGE 膠看起來和篩多態似的（2333333）。只要有除了 Marker 之外的條帶出現就好辦多了，充分說明現在：電泳槽 OK、PAGE 膠 OK、PCR 儀 OK、擴增 PCR 的混合物體系 OK、公用引物 OK，只剩zui后一個敵人：

 某些樣品的 DNA 質量。提 DNA 這種技術活，還是請自己實驗室的師兄師姐多教多學多練習去吧，能說的無非就是，植物樣品的話，葉片比種子好提多了，質量效果也棒，能發苗提葉片 DNA，就不要按著種子不放了。

 極少數極少數會出現某些引物與 DNA 結合效率較低或有選擇特異性的情況，提高了樣品 DNA 質量和濃度、改變了引物濃度、嘗試了不同退火溫度之后仍然無果，現在在要求不高、公用引物很多、尚且還在基因連鎖的階段，怎么辦呢，建議你：

換引物。

換好用的引物。

這是多么明智的選擇啊！

4、 還有的時候偶爾會有這樣的情況，比如：

 條帶都還正常，就是染色出來顏色過淺或者過深，想想是不是銀染的時候次漂洗沒有用去離子水（自來水中有 Cl—，會結合 Ag+ 生成沉淀、帶走 Ag+）、漂洗次數過多（不要超過 2 次就夠啦）、堿性溶液中的甲醛是不是滴加的多了少了；

 整個膠面背景比較臟，雜帶很多，要不要稍微提高一點點 PCR 程度中的退火溫度、或者減少一點點 rRaq 酶的用量、或者樣品的模板 DNA 濃度降低一丟丟（DNA 濃度在 30-80ng/ul 之間比較合適，太高了也會有很多雜帶）？

分子實驗一般是結果導向的，根據結果找原因，多數的原因應該大致就像這樣了。