1. 前目

葉綠體是綠色植物組織中一種重要的器官，其主要功能是執行光合作用。除此之外 ，許多重要的化合物也在葉綠體內合成，如植物激素、脂肪酸和油脂、氨基酸、維生素、嘌呤、嘧啶核酸、四吡咯類化合物及類異戊二烯等。葉綠體也是植物細胞內同化氮和硫的場所 。其內包含有大量的蛋白質結合伴侶、定位元件、輔因子伴侶、組裝元件、肽酶及蛋白酶等，對于蛋白質生物合成和胞內平衡具有重要作用。葉綠體內的蛋白質種類多樣，包括與質體 DNA 及 mRNA 結合的蛋白質，這些蛋白質對葉綠體內基因的表達具有重要作用 。據估計，與不同種類質體結合的蛋白質共計 2000~4000 種。其中約 550 種是含有 α 螺旋的跨膜蛋白或者膜結合蛋白 ，而葉綠體基質則含有多于 1000 種的蛋白質。到目前為止，已經有許多研究對擬南芥類囊體和葉綠體膜蛋白質組進行了詳細的探討 。

本章介紹的葉綠體分離方法主要是基于 David  Christopher 博士，以擬南芥為材料所發展出來的一種方法，同時還參考了一些已經發表的從豌豆和菠菜中分離葉綠體的方法 。在上述基礎上，我們進一步優化了分離方法，并將其用于本實驗室大規模的葉綠體分離和蛋白質組分析工作中 。這種方法沒有進行過葉綠體蛋白質輸入活性的測試，但是本方法具有產率高，污染低的優點，尤其適合于葉綠體的蛋白質組分析。關于用于體外蛋白質輸入活性試驗的葉綠體分離方法，可以參考其他的一些報道  。

2. 材料
( 1 ) 介質 A  ( 勻漿緩沖液，見注釋 1)：50 mmol/L HEPES-KOH ( pH 8.0) 、330 mmol/L 山梨醇、2 mmol/L EDTA -Na2  ( pH 8.0 )、5 mmol/L 抗壞血酸維生素 C 、5 mmol/L 半胱氨酸，0.05% 牛血清白蛋白 （BSA ) (可以忽略以減少對后所得樣品的污染，見注釋 1)。
( 2 ) 介質 B ( 清洗溶液）：50 mmol/L HEPES-KOH ( pH 8.0) 、330 mmol/L 山梨醇、2 mmol/L EDTA-Na2 ( pH  8. 0)。
( 3 ) 介質 C ( 裂解液）：10 mmol/L HEPES-KOH ( pH 8.0) 、5 mmol/L MgCl2、蛋白酶混合抑制劑
( 4 ) 100% PF-Percoll：0.8 g PEG 8000、0.27 g Ficoll  400000，加 Percoll 至終體積為 27.5 ml。
( 5 ) Percoll 梯度：PF Percoll  ( 40% 或 85% ) 、0.5 mmol/L EDTA、50 mmol/L HEPES-KOH ( pH 8.0) 、330 mmol/L sorbitol。
( 6 ) 濃縮離心設備（包含 3kDa 過濾器，如 Millipore 公司的 Amicon 3kDa)。

4. 注釋
( 1 ) 制備 1 L 介質 A：60.1 g 山梨醇、50 ml  1 mol/L HEPES-KOH 貯存液（ pH 8.0) 、4 ml  0.5 mol/L EDTA  (滅菌貯存液），加雙蒸水至終體積 1 L。使用前新鮮加入 0.88 g 抗壞血酸維生素 C 、0.6 g 半胱氨酸和 0.5 g BSA  ( 可以忽略以降低對終葉綠體樣品的污染）。
( 2 ) —般 40~50 株*生長的擬南芥植物材料須用 1 L 研磨緩沖液。的比例和研磨時間根據不同的實驗室和操作者根據各自的經驗確定。
( 3 ) 尼龍布在使用前用研磨緩沖液浸濕。
( 4 ) Percoll 非連續密度梯度制備，直接在 85% Percoll 表面慢慢注入 40% Percoll，或者用移液管在 40% Percoll 下面注入 85% Percoll 即可。
( 5 ) 葉綠素濃度測定參照文獻 [ 20 ] 進行。將 2~5 μl 葉綠體或類囊體溶液加入 1 ml 80% 冰上預冷的丙酮中，振蕩后在暗處于冰上靜置 10 min。4°C 條件下 15000 g 離心 5 min。收集綠色上清液部分，測定其在 663.2 nm 及 646.8 nm 處的吸光值。葉綠素 a 濃度 + 葉綠素  b 濃度（ μg/ml)  = ( 1+v）/v X（7.15X A663.2 + 18.71 X A646.8 ) 。
( 6 ) 也可以直接在 300000 g 條件下離心 25 min，然后收集類囊體和包膜結構。但是在這種離心力下得到的沉淀難以重新懸浮，同時，高離心力可能會導致囊腔和一些外膜蛋白流失到基質蛋白部分。