詳細(xì)介紹
實(shí)時(shí)熒光定量PCR:
實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測(cè)的局限,實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測(cè)一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度,并記錄在電腦軟件之中,通過(guò)對(duì)每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此,實(shí)時(shí)熒光定量PCR無(wú)需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上的:
1)Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí),剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期(對(duì)數(shù)期),此時(shí)微小誤差尚未放大,因此Ct值的重現(xiàn)性*,即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增,得到的Ct值是恒定的。
2)Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系,可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品進(jìn)行定量測(cè)定,因此,實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。
外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量準(zhǔn)確,重現(xiàn)性的定量方法,已得到*的*,廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究,藥物療效考核、病原體檢測(cè)等諸多領(lǐng)域。
產(chǎn)品名稱 | 英文名稱 | 貨號(hào) |
Enterocytozoon bieneusi | EY-P6669 |
熒光化學(xué)物質(zhì):
實(shí)時(shí)熒光定量PCR所使用的熒光物質(zhì)可分為兩種:熒光探針和熒光染料。現(xiàn)將其原理簡(jiǎn)述如下:
1. TaqMan熒光探針:PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針,該探針為一寡核苷酸,兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí),報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收;PCR擴(kuò)增時(shí),Taq酶的5'-3'外切酶活性將探針酶切降解,使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離,從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào),即每擴(kuò)增一條DNA鏈,就有一個(gè)熒光分子形成,實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術(shù)既可進(jìn)行基因定量分析,又可分析基因突變(SNP),有望成為基因診斷和個(gè)體化用藥分析的技術(shù)平臺(tái)。
2. SYBR熒光染料:在PCR反應(yīng)體系中,加入過(guò)量SYBR熒光染料,SYBR熒光染料非特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后,發(fā)射熒光信號(hào),而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào),從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加*同步。SYBR僅與雙鏈DNA進(jìn)行結(jié)合,因此可以通過(guò)溶解曲線,確定PCR反應(yīng)是否特異。
3. 分子信標(biāo):是一種在5和3末端自身形成一個(gè)8個(gè)堿基左右的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探針,兩端的核酸序列互補(bǔ)配對(duì),導(dǎo)致熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)緊緊靠近,不會(huì)產(chǎn)生熒光。PCR產(chǎn)物生成后,退火過(guò)程中,分子信標(biāo)中間部分與特定DNA序列配對(duì),熒光基因與淬滅基因分離產(chǎn)生熒光 。
熒光定量PCR服務(wù):
公司推出,該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍,而且與常規(guī)PCR相比,它具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問(wèn)題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn),目前該技術(shù)已被廣泛用于檢測(cè)細(xì)胞mRNA表達(dá)量的變化;比較不同組織的mRNA表達(dá)差異;驗(yàn)證基因芯片,siRNA干擾的實(shí)驗(yàn)結(jié)果等。我公司為您提供全套實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)服務(wù),全部實(shí)驗(yàn)皆使用進(jìn)口試劑完成,主要定量PCR儀器。
1、熒光定量PCR服務(wù)要求:
(01)請(qǐng)您提供新鮮的且盡量多的材料;或直接提供純化好的總RNA(大于 5 ug/樣品);或直接提供純化好的DNA(大于 5 ug/樣品)。
(02)請(qǐng)?zhí)峁┮阎娜L(zhǎng)基因序列。
(03)請(qǐng)?zhí)峁┍M可能詳細(xì)的背景資料:DNA/RNA 來(lái)源等
2、熒光定量PCR操作程序
(01)引物(探針)設(shè)計(jì)與合成。
(02)提取DNA/RNA,樣本逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。
(03)進(jìn)行Real Time PCR實(shí)驗(yàn),進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析。
(04)實(shí)驗(yàn)完成后,提供完整的實(shí)驗(yàn)報(bào)告(含軟件分析結(jié)果)及引物等實(shí)驗(yàn)材料。
3、熒光定量PCR的收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn):
我公司根據(jù)客戶的樣品數(shù)量進(jìn)行不同的收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)。
幾種傳統(tǒng)熒光定量PCR方法簡(jiǎn)介:
1)內(nèi)參照法:
在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物,內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記,下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時(shí),內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中,由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長(zhǎng)度不同,二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開(kāi)來(lái),分別測(cè)定其熒光強(qiáng)度,以內(nèi)標(biāo)為對(duì)照定量待檢測(cè)模板。
2)競(jìng)爭(zhēng)法:
選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競(jìng)爭(zhēng)性模板。在同一反應(yīng)管中,待測(cè)樣品與競(jìng)爭(zhēng)模板用同一對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增(其中一個(gè)引物為熒光標(biāo)記)。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物,競(jìng)爭(zhēng)性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個(gè)片段,而待測(cè)模板不被酶切,可通過(guò)電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開(kāi),分別測(cè)定熒光強(qiáng)度,根據(jù)已知模板推測(cè)未知模板的起始拷貝數(shù)。
3)PCR-ELISA法:
利用或生物素等標(biāo)記引物,擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合,再加入抗或生物素酶標(biāo)抗體-辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合物,終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR-ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn),若加入內(nèi)標(biāo),作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,也可實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)目的。
鹽酸環(huán)胞苷100克 人血纖蛋白原(Fbg)ELISA 試劑盒 96T/48T 試劑盒 組裝/原裝
(熒光染料) 豬血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)免疫試劑盒 Pig Angiotensin Conveing Enzyme,ACE ELISA Kit
洋槐豆膠,英文名或英文縮寫(xiě):Locust bean gum,級(jí)別:CP,70%,規(guī)格:1克 HumanIerferoninducibleT-cellChemoatacta,I-TACELISAKit 人干擾素誘導(dǎo)T細(xì)胞趨化因子(ITAC/CXCL11)ELISA試劑盒 96T/48T 進(jìn)口分裝
拂硼醋銨 cmmonium fluoborctq 1386-83-0 Humanlipoproteinα,Lp-αELISA試劑盒人脂蛋白α(Lp-α)ELISA試劑盒規(guī)格:96T/48T
本基二錄化膦 Dichlorophqnylphosphinq 644-97-3 組織溶酶體型酸性酶總活性比色法定量檢測(cè)試劑盒20次
球蛋白抗原兔IgGshēng huà shì jì容量:12毫升 咖啡環(huán)氨酸(cyclamate)含量高效液相色譜法定量檢測(cè)試劑盒20次
951-78-02’-脫氧尿苷2'-Deoxyuridine ELISAKitSRB/CD36人清道夫受體B規(guī)格:48T/96T
15-150kDa精確分子量MARK5克 小鼠白介素13(IL-13)ELISA 試劑盒 96T/48T 試劑盒 組裝/原裝
2,6-二氧基 2,6-Dimqthoxyncphclqnq 2486-22-2 Rat nerve growth factor (NGF) ELISA Kit 大鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)ELISA試劑盒
吲哚美辛1克RT,避光 HumanCrosslaps,CrELISAKit 人骨膠原交聯(lián)(Cr)ELISA試劑盒 96T/48T 進(jìn)口分裝
精脒,英文名或英文縮寫(xiě):Spermidine,級(jí)別:BR,98%,規(guī)格:1克 英文名稱MouseMIP-5ELISAKit小鼠巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-5(MIP-5)規(guī)格:96T/48T
HE瓊脂HEKTOEN ENTERIC AGAR FOR 冰凍切片b-葡糖苷酸酶活性染色試劑盒50次
Aluminum鋁絲50毫克AR,99% Rabbiturokinaseplasminogenactivator,uPAELISA試劑盒兔尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)ELISA試劑盒規(guī)格:96T/48T
均本四加醋 1,2,4,5-Bqnzqnqtqtrcccrboxylic ccid 1989-2-4 小鼠α-乳清蛋白(αLA)ELISA試劑盒 ,英文名: αLA ELISA Kit
米力農(nóng) Milrinonq 78412-7- 人白三烯E4(LTE4)ELISA檢測(cè)試劑盒HumanleukoieneE4,LT-E4ELISAKit 96T/48T
比氏腸微孢蟲(chóng)探針?lè)晒舛?/span>PCR試劑盒赤霉酸,英文名或英文縮寫(xiě):Gibberellin A3,級(jí)別:USP級(jí),95-105%,規(guī)格:200u 豬水泡性口炎病毒(VSV)核酸檢測(cè)試劑盒(-PCR法) 48T
66009-10-7D(+)-密二糖一水 》99.0%6-O-ALPHA-D-GALACTOPYRANOSYL-D-GLUCOSE MONOHYDRATE HumanPhospholipidaseA2,PL-A2ELISA試劑盒人1脂酶A2(PL-A2)ELISA試劑盒規(guī)格:96T/48T
etxylp-toluesulfonate4-磺酸乙酯25克CP ELISAKitIL-18豬白介素18規(guī)格:48T/96T
1,3-炳烷磺醋內(nèi)酯 1,3-Propcnqsultonq 110-71-4 HumancytotoxicTlymphocyteassociatedaigen4,CTLA-4ELISAKit人細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(CTLA-4/CD152)ELISA試劑盒規(guī)格:96T/48T
基炳烯酰安 MqthccrylcMidq;MqthylccrylcMidq 79-39-0 人舒(Sufeanil)ELISA 試劑盒 96T/48T 試劑盒 組裝/原裝