智慧城市網
技術文章
DIGE熒光差異蛋白的特點及應用
閱讀：1097 發布時間：2016-2-26DIGE熒光差異蛋白表達分析系統在傳統雙向電泳技術的基礎上，結合了多重熒光分析的方法，在同一塊膠上共同分離多個分別由不同熒光標記的樣品，并*次引入了內標的概念，極大地提高了結果的準確性，可靠性和重復性。在DIGE技術中，每個蛋白點都有它自己的內標，并且軟件全自動根據每個蛋白點的內標對其表達量進行校準，保證所檢測到的蛋白豐度變化是真實的。DIGE技術可檢測到樣品間小于10%的蛋白表達差異，統計學可信度達到95%以上。ELISA試劑盒
熒光染料種類雖多，但用于蛋白質組樣品標記的熒光染料不同于普通熒光染料，標記后的蛋白質不應該有等電點上的改變，分子量上的改變也應該保持zui小而且不同熒光染料導致的分子量的改變應該一致。用于蛋白質預先標記的熒光染料分為兩類，zui小標記和飽和標記。其中zui小標記熒光染料包括三種，分別是Cy2，Cy3和Cy5。這三種熒光染料化學結構上相似，分子量接近，帶有相同的活化基團-NHS脂，可以特異性的標記在賴氨酸殘基的ε氨基上，由于三種染料均帶有一個正電荷，這樣通過取代反應蛋白質的等電點不會發生改變，保證了不同樣品中的相同蛋白質可以泳動到相同的位置。不過要注意，過多的染料標記會導致蛋白質的疏水性增加而不易溶解。保持1～2 %的蛋白質的賴氨酸殘基被熒光標記修飾，才可以維持被標記的蛋白在電泳時的溶解性，因此，在標記樣品時，保證合適的蛋白質和染料的摩爾數比例至關重要。通過調整合適的pH值、合適的染料和蛋白質的摩爾比，可以保證每個蛋白質分子zui多只標記上一個染料分子，來保證蛋白質的分子量變化zui小。ELISA試劑盒
一、主要特點：
1. DIGE熒光差異分析，用于檢測蛋白表達中真實的生物學差異，并對差異進行定量。
2. DIGE技術結合了蛋白質組學研究中經典的雙向電泳技術和*的多重熒光分析技術。
3. 不同的樣品分別由電荷和分子量匹配的DIGE熒光標記物預標記，隨后再混合并在同一塊膠上跑電泳。
4. 常規檢測到小于10%的蛋白表達差異而統計學可信度達到95%。
二、實驗流程：
1. 為保證實驗順利進行，須對樣本進行預實驗，以檢測甲方提供的樣品是否合格。
2. 預實驗順利完成后，進行正式實驗，電泳前以Cy2、Cy3 和Cy5三種熒光染料分別標記蛋白質樣品（其中包括一個蛋白質內標），將標記好的蛋白質樣品混合，在同一塊膠上進行雙向電泳，電泳結果分別用3種不同的激發波長得到不同顏色的熒光信號，根據這些信號的比例來判定樣品之間蛋白質的差異。DIGE技術可檢測到樣品間小于10%的蛋白表達差異，統計學可信度達到95%以上。
3. 質譜分析（包括膠內酶切、串聯質譜分析和數據庫檢索）
4、蛋白點的質譜鑒定：質譜的數據通過MASCOT數據庫檢索來確定蛋白點所對應的基因
三、主要應用：
采用DIGE技術，通過對不同類型，不同個體的細胞、組織、或經過不同處理和不同生長條件下蛋白質表達差異分析，在研究疾病的分子機理、分子診斷、藥物作用機理、毒理學等方面都有廣泛的應用。尤其是通過對各種疾病組織和正常組織進行比較，可以得到針對特定疾病（例如腫瘤）的一些標記蛋白質，得到的這些蛋白質可以用來作為疾病分子診斷的標記，或為進一步的疾病治療以及藥物開發提供有價值的信息。 DIGE是目前蛋白質組學研究中可信度和準確率zui高的技術之一，是已經經過驗證并且被許多的蛋白質組學研究部門肯定的技術。DIGE技術已經在各種樣品中得到應用，包括人、大鼠、小鼠、真菌、細菌等，主要用于蛋白質組學，如各種腫瘤研究，尋找疾病分子標志物，揭示藥物作用的分子機制或毒理學研究等方面。ELISA試劑盒