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ELISA老不成功,讓上海撫生告訴你錯在哪兒?

閱讀:289發布時間:2019-6-4

                            ELISA老不成功,讓上海撫生告訴你錯在哪兒?

 


ELISA素來以靈敏度較高、特異性較好的特點在臨床上得到了廣泛的應用。而它作為經典的免疫檢測方法,雖然看似平常但是要真正將該實驗做好并不容易,酶標板的讀值總是會不盡如人意,可見實操中的各個環節對該實驗的檢測效果影響較大,如不注意,就會產生一些糟心的實驗結果。

 

問題1
低信號強度


如果ELISA讀數低于吸光度下限(<>

 

解決方案:

 

1.增加抗體的孵育時間。如果依照protocol在室溫下孵育您的抗體2小時后的實驗結果并不理想,那么可以嘗試在4°C孵育過夜。如此,可允許抗原抗體上的結合,并能擴大ELISA中的反應信號。

 

2.增加二抗-酶結合物的濃度。ELISA中的E代表酶(通常是辣根過氧化物酶,HRP),它與底物(通常是TMB)反應后可產生鮮艷的藍色。因而,將HRP濃度提高50%或將其加倍,則會產生更強的顏色,易于檢測。

 

3.充分避光,以保護TMB基質不受光照影響,并確保其能大限度地發揮其性能。考慮到TMB對光線非常敏感,因而在黑暗中進行ELISA平板的顯色反應會產生更強的信號。

 

問題2
高背景


ELISA板上的空白孔通常被用作為陰性對照,當該組中任意孔的讀數明顯大于0,這均表示實驗背景有問題。

 

解決方案:

 

1.室溫過高,可能會導致實驗結果偏高。因而,如果發現所有的實驗孔的讀數均偏高,請注意控制恒溫箱溫度,盡可能將其穩定在37℃左右。

 

2.平板孔內因清洗不*,而導致有酶或底物殘留,同樣會產生高背景。此時需要按照protocol對ELISA平板進行清洗,可不任意減少洗板液的體積以及洗板次數,同時也需要按要求操作,并適當延長清洗液浸泡孔的時間。

 

3.加樣或加酶時導致了陰性孔的污染。此時需要及時更換吸頭以避免造成污染,切忌僥幸心理。

 

4.試劑過期或被污染。實驗操作過程中不要使用過期試劑,并防止組分污染。如使用容器時,應注意容器的清潔。

 

問題3
重復性不好


同一個樣本間的各個復孔的讀數有顯著性差異。

 

解決方案:

 

1.加樣量多少不一,操作時間長短不一。重復同一樣本時,加樣量與加樣時間理應相同,同時也應注意移液器的校準。加樣后可輕微晃動酶標板使反應液充分混合。

 

2.樣本應保證一致、無污染,并應該由同一名操作人員進行操作。

 

3.精密度測定方法不標準,此時理應采用正確的方法進行操作。

 

問題4
干擾


干擾物質如清洗劑或NADH(存在于血清中)可能會影響ELISA平板的吸光度讀數并使得實驗結果偏離真實結果。

 

解決方案:

 

1.嚴格按照protocol進行實驗操作。通常protocol中會指出會對實驗產生干擾的化學物質,以及會告知實驗者如何避免它們。比如在進行血紅蛋白干擾的血清測定中,通常會建議不要使用溶血的血清樣品。

 

2.有時可能你也別無選擇,只能使用含有干擾物質的樣品。如果你感興趣的抗原濃度較高,可以使用一個濃度較低但仍易于檢測的樣品稀釋液,如此可以稀釋樣本中的干擾物質并降低其對實驗的干擾。

 

問題5
陽性與陰性不能達到2.1的比值


陰性顏色太深,又或者陽性顏色太淺。

 

解決方案:

 

1.當陰性顏色太深時,則陰性對照(也就是陽性對照的除目標抗原外的其它成分)中可能有某種成分與一抗作用。此時可通過純化抗原除去干擾成分。

 

2.當陽性顏色太淺時,原因可能有3個:一抗效價不好,換用一抗或增加一抗用量;抗原太稀,增加抗原濃度;封閉時間過長,應縮短封閉時間,封閉時間一般37攝氏度2個小時,或者4攝氏度過夜。

 

問題6
增加抗原濃度,一抗濃度不變,顯色反應沒有表現出應有的梯度


 一抗與抗原的比例已經飽和。

 

解決方案: 

 

增加一抗用量; 或在一抗用量不變的情況下減少抗原濃度做梯度。

 

問題7
增加一抗濃度,抗原濃度不變,顯色反應沒有表現出應有的梯度


一抗與抗原的比例已經飽和。

 

解決方案:

 

增加抗原用量;或在抗原用量不變的情況下減少一抗濃度做梯度。

 

問題8
加完TMB顯色后顏色梯度很明顯,但加了硫酸終止反應后顏色梯度沒有那么明顯了


硫酸可能把其它成分都炭化了

 

解決方案:

 

加少一點硫酸,參考值:50 μlTMB+35 μl硫酸;或者采用1M的HCL作為終止液,50ulTMB+50ul1M HCL。


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