實(shí)驗(yàn)原理
微生物細(xì)胞的大小是微生物重要的形態(tài)特征之一，由于菌體微小，只能在顯微鏡下測量。用于測量微生物細(xì)胞大小的工具有目鏡測微尺和鏡臺(tái)測微尺。
目鏡測微尺（圖示）是一塊圓形玻片，在玻片*把5mm長度刻成50等分，或把10mm長度刻成100等分。測量時(shí)，將其放在接目鏡中的隔板上，此處正好與物鏡放大的中間物像重迭，用于測量經(jīng)顯微鏡放大后的細(xì)胞物象。由于不同目鏡、物鏡組合的放大倍數(shù)不相同，目鏡測微尺每格實(shí)際表示的長度也不一樣，因此目鏡測微尺測量微生物大小時(shí)須先用置于鏡臺(tái)上的鏡臺(tái)測微尺校正，以求出在一定放大倍數(shù)下，目鏡測微尺每小格所代表的相對(duì)長度。鏡臺(tái)測微尺（圖示）是*部分刻有等分線的載玻片，一般將1mm等分為100格，每格長10μm即0.01mm，是專門用來校正目鏡測微尺的。校正時(shí)，將鏡臺(tái)測微尺放在載物臺(tái)上，由于鏡臺(tái)測微尺與細(xì)胞標(biāo)本是處于同一位置，都要經(jīng)過物鏡和目鏡的兩次放大成像進(jìn)入視野，即鏡臺(tái)測微尺隨著顯微鏡總放大倍數(shù)的放大而放大，因此從鏡臺(tái)測微尺上得到的讀數(shù)就是細(xì)胞的真實(shí)大小，所以用鏡臺(tái)測微尺的已知長度在一定放大倍數(shù)下校正目鏡測微尺，即可求出目鏡測微尺每格所代表的實(shí)際長度，然后移去鏡臺(tái)測微尺，換上待測標(biāo)本片，用校正好的目鏡測微尺在同樣放大倍數(shù)下測量微生物細(xì)胞大小。
測定微生物細(xì)胞數(shù)量的方法很多，通常采用的有顯微鏡直接計(jì)數(shù)法和稀釋平板計(jì)數(shù)法。
直接計(jì)數(shù)法適用于各種單細(xì)胞菌體的純培養(yǎng)懸浮液，如有雜菌或雜質(zhì)，則難于直接測定。菌體較大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球計(jì)數(shù)板，一般細(xì)菌則采用彼德羅夫·霍澤（Petrof Hausser）細(xì)菌計(jì)數(shù)板。兩種計(jì)數(shù)板的原理和部件相同，只是細(xì)菌計(jì)數(shù)板較薄，可以使用油鏡觀察。而血球計(jì)數(shù)板較厚，不能使用油鏡，計(jì)數(shù)板下部的細(xì)菌難于區(qū)分。
血球計(jì)數(shù)板是一塊特制的厚型載玻片，載坡片上有4條槽所構(gòu)成的3個(gè)平臺(tái)。中間的平臺(tái)較寬，其中間又被一短橫槽分隔成兩半，每個(gè)半邊上面各有一個(gè)計(jì)數(shù)區(qū)（圖示），計(jì)數(shù)區(qū)的刻度有兩種：一種是計(jì)數(shù)區(qū)分為16個(gè)大方格，大方格用三線隔開，而每個(gè)大方格又分成25個(gè)小方格；另一種是一個(gè)計(jì)數(shù)區(qū)分成25個(gè)大方格，大方格之間用雙線分開，而每個(gè)大方格又分成16個(gè)小方格。但是不管計(jì)數(shù)區(qū)是哪一種構(gòu)造，它們都有一個(gè)共同特點(diǎn)，即計(jì)數(shù)區(qū)都由400個(gè)小方格組成（圖示）。
計(jì)數(shù)區(qū)邊長為1mm，則計(jì)數(shù)區(qū)的面積為1mm2，每個(gè)小方格的面積為1/400 mm2。蓋上蓋玻片后，
計(jì)數(shù)區(qū)的高度為0.1mm，所以計(jì)數(shù)區(qū)的體積為0.1mm3，每個(gè)小方格的體積為1/4000 mm3。
使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)時(shí)，先要測定每個(gè)小方格中微生物的數(shù)量，再換算成每mL菌液（或每g樣品）中微生物細(xì)胞的數(shù)量。
已知：1mL體積＝10 mm×10 mm×10 mm＝1000mm3
所以：1mL體職應(yīng)含有小方格數(shù)為1000mm3/（1/4000mm3）＝4×106個(gè)小方格，即系數(shù)K＝4×106。
因此：每mL菌懸液中含有細(xì)胞數(shù)＝每個(gè)小格中細(xì)胞平均數(shù)（N）×系數(shù)（K）×菌液稀釋倍數(shù)（d）。
六、實(shí)驗(yàn)材料
活材料：釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）斜面菌種或培養(yǎng)液、枯草桿菌（Bacillus subtilis）染色標(biāo)本片。不選用大腸桿菌作試驗(yàn)菌？
七、實(shí)驗(yàn)用品
顯微鏡、目鏡測微尺、鏡臺(tái)測微尺、蓋玻片（22mm×22mm）、載玻片、滴管、雙層瓶、擦鏡紙、血球計(jì)數(shù)板、吸水紙、計(jì)數(shù)器。
八、實(shí)驗(yàn)方法
（一）微生物細(xì)胞大小的測定
1、目鏡測微尺的校正
把目鏡的上透鏡旋下，將目鏡測微尺的刻度朝下輕輕地裝入目鏡的隔板上，把鏡臺(tái)測微尺置于載物臺(tái)上，刻度朝上。先用低倍鏡觀察，對(duì)準(zhǔn)焦距，視野中看清鏡臺(tái)測微尺的刻度后，轉(zhuǎn)動(dòng)目鏡，使目鏡測微盡與鏡臺(tái)測微尺的刻度平行，移動(dòng)推動(dòng)器，使兩尺重迭，再使兩尺的“0"刻度*重合，定位后，仔細(xì)尋找兩尺第二個(gè)*重合的刻度（圖示），計(jì)數(shù)兩重合刻度之間目鏡測微尺的格數(shù)和鏡臺(tái)測微尺的格數(shù)。因?yàn)殓R臺(tái)測微尺的刻度每格長10μm，所以由下列公式可以算出目鏡測微尺每格所代表的實(shí)際長度。
目鏡測微尺每格長度
例如：目鏡測微尺5小格正好與鏡臺(tái)測微尺5小格重迭，已知鏡臺(tái)測微尺每小格為10μm
目鏡測微尺上每小格長度為。
用同樣方法分別校正在高倍鏡下和油鏡下目鏡測微尺每小格所代表的長度。
由于不同顯微鏡及附件的放大倍數(shù)不同，因此校正目鏡測微尺必須針對(duì)特定的顯微鏡和附件（特定的物鏡、目鏡、鏡筒長度）進(jìn)行，而且只能在該顯微鏡上重復(fù)使用，當(dāng)更換不同顯微鏡目鏡或物鏡時(shí)，必須重新校正目鏡測微尺每一格所代表的長度。刻度重合
2、細(xì)胞大小的測定
⑴將酵母菌斜面制成一定濃度的菌懸液（10－2）。
⑵取一滴酵母菌菌懸液制成水浸片。
⑶移去鏡臺(tái)測微尺，換上酵母菌水浸片，先在低倍鏡下找到目的物，然后在高倍鏡下用目鏡測微尺來測量酵母菌菌體的長，寬各占幾格，不足一格的部分估計(jì)到小數(shù)點(diǎn)后一位數(shù)。測出的格數(shù)乘上目鏡測微尺每格的校正值，即等于該菌的長和寬。一般測量菌體的大小要在同一個(gè)標(biāo)本片上測定10～20個(gè)菌體，求出平均值，才能代表該菌的大小。待測微生物需用培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生*的菌體進(jìn)行測定。
⑷同樣方法用油鏡測定枯草桿菌染色標(biāo)本的細(xì)胞大小。
（二）微生物細(xì)胞的顯微直接計(jì)數(shù)法
1、視待測菌懸液濃度，加無菌水適量稀釋（斜面一般稀釋到10－2），以每小格的菌數(shù)可數(shù)為度。
2、取潔凈的血球計(jì)數(shù)板一塊，在計(jì)數(shù)區(qū)上蓋上一塊蓋玻片。
3、將酵母菌懸液搖勻，用滴管吸取少許，從計(jì)數(shù)板中間平臺(tái)兩側(cè)的溝槽內(nèi)沿蓋玻片的下邊緣滴入一小滴，不宜過多，讓菌懸液利用液體的表面張力充滿計(jì)數(shù)區(qū)，勿使氣泡產(chǎn)生，并用吸水紙吸去溝槽中流出的多余菌懸液。也可以將菌懸液直接滴加在計(jì)數(shù)區(qū)上，注意不要使計(jì)數(shù)區(qū)兩邊平臺(tái)沾上菌懸液，以免加蓋蓋玻片后，造成計(jì)數(shù)區(qū)深度的升高。然后加蓋蓋玻片，勿使產(chǎn)生氣泡。
4、靜置片刻，將血球計(jì)數(shù)板置載物臺(tái)上夾穩(wěn)，先在低倍鏡下觀察到計(jì)數(shù)區(qū)后，再轉(zhuǎn)換高倍鏡觀察并計(jì)數(shù)。由于活細(xì)胞的折光率和水的折光率相近，觀察時(shí)應(yīng)適當(dāng)關(guān)小孔徑光闌并減弱光照的強(qiáng)度。
5、計(jì)數(shù)時(shí)若計(jì)數(shù)區(qū)是由16個(gè)大方格組成，按對(duì)角線方位，數(shù)左上、左下、右上、右下的4個(gè)大方格（即100小格）的菌數(shù)。如果是25個(gè)大方格組成的計(jì)數(shù)區(qū)，除數(shù)上述四個(gè)大方格外，還需數(shù)*1個(gè)大方格的菌數(shù)（即80個(gè)小格）。如菌體位于大方格的雙線上，計(jì)數(shù)時(shí)則數(shù)上線不數(shù)下線，數(shù)左線不數(shù)右線，以減少誤差。
6、對(duì)于出芽的酵母菌，芽體達(dá)到母細(xì)胞大小一半時(shí)，即可作為兩個(gè)菌體計(jì)算。每個(gè)樣品重復(fù)計(jì)數(shù)2～3次，每次數(shù)值不應(yīng)相差過大，否則應(yīng)重新操作，求出每一個(gè)小格中細(xì)胞平均數(shù)（N），按公式計(jì)算出每mL(g)菌懸液所含酵母菌細(xì)胞數(shù)量。
7、測數(shù)完畢，取下蓋玻片，用水將血球計(jì)數(shù)板沖洗干凈，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免損壞網(wǎng)格刻度。洗凈后自行晾干或用吹風(fēng)機(jī)吹干，放入盒內(nèi)保存。
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