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動物實驗樣本前期處理方法解析

閱讀:881發布時間:2016-3-3

    在Elisa試劑盒發展的過程中,樣本前處理技術一直沒有受到重視,相對與現代分析技術的快速發展,樣本前處理技術以及儀器的發展滯后并制約了分析化學的發展,在過去的很多年中,分析化學的發展集中在研究分析方法的本身:如何提高Elisa靈敏度、選擇性以及分析速度;如何應用物理、化學、生物學等方面的理論來發展新的分析方法與技術,以滿足新技術對分析化學提出的新目標與高要求;如何采用新技術的成果改進分析儀器的性能、速度、以及自動化的程度。長期以來忽視對前處理方法與技術的研究,是樣本前處理技術成為制約分析化學發展的瓶頸。

一、勻漿介質的制備:

    一般采用pH 7.4, 0.01mol/L Tris-HCl, 1mmol/L EDTA-2Na, 0.01mol/L蔗糖,0.8%氯化鈉溶液或直接用0.86%的生理鹽水作為勻漿介質。

二、組織勻漿的制備

1、取組織塊(0.1g~0.2g)zui少可到2~5mg在冰冷的生理鹽水中漂洗,除去血液,濾紙拭干,準確稱重,放入5ml的勻漿管中。

2、按重量(g):體積(ml)=1:9的比例加入9倍體積的勻漿介質(pH7.4, 0.01mol/L Tris-HCl,1mmol/L EDTA-2Na ,0.01mol/L蔗糖,0.8%的氯化鈉溶液)或者0.86%的生理鹽水于勻漿管中,冰水浴條件下,用眼科小剪盡快剪碎組織塊。

3、勻漿的方式有多種:手工勻漿,機器勻漿,超聲粉碎。

① 手工勻漿:左手持勻漿管將下端插入盛有冰水混合物的器皿中,右手將搗桿垂直插入套管中,上下轉動研磨數十次(6~8分鐘),充分研碎,制成10%的勻漿液。

② 機器勻漿:用組織搗碎機10000~15000 轉/分 上下研磨制成10%組織勻漿,也可用內切式組織勻漿機制備(勻漿時間10秒/次,間隙30秒,連續3~5次,在冰水中進行),皮膚、肌肉組織等可延長勻漿時間。

③ 超聲粉碎:用超聲粉碎機進行粉碎,可用Soniprep150型超聲波發生器以振幅14微米超聲處理30秒使細胞破碎,也可用國產超聲波發生儀,用400安培,5秒/次,間隙10秒反復3~5次。

鏡檢觀察:取少量組織勻漿作涂片(直接涂片、染色均可以),顯微鏡下觀察細胞是否破碎,若沒有則可延長勻漿時間。

4、將制備好的10%勻漿液用普通離心機或低溫低速離心機2500轉/分左右,離心10~15分鐘,取上清液進行測定.

三、樣本保存:

    動物組織樣本暫時不測定,可立即低溫凍存,溫度越低越好,中間如*凍融,-20℃以下可保存三個月,-70℃以下可保存六個月。

    制備好的勻漿液建議不要凍存,當天進行測定,如放置時間過長相關酶活會有所下降,部分指標4℃可存放3~5天(如SOD要存放2~3天,MDA可存放3~5,總蛋白測定可存5~7天等)。

    對臨床檢驗ELISA測定中出現的假陽性或假陰性結果,要從多方面進行分析除試劑因素和操作因素之外,更多的應從標本因素方面進行分析,并采取相應措施排除干擾作用。


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