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貨號	BJ-01X6355

中文名稱：Alexa Fluor 488/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒

英文名稱：Annexin V-Alexa Fluor 488/PI Apoptosis Detection Kit

產(chǎn)品規(guī)格：50次

產(chǎn)品貨號：BJ-01X6355

本試劑盒是一種采用Annexin V-Alexa Fluor 488與PI雙染法進(jìn)行細(xì)胞早期凋亡分析的檢測試劑盒。

細(xì)胞凋亡早期改變發(fā)生在細(xì)胞膜表面，這些細(xì)胞膜表面的改變之一是磷脂酰絲(PS)從細(xì)胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外，使PS暴露在細(xì)胞膜外表面。PS是一種帶負(fù)電荷的磷脂，正常主要存在于細(xì)胞膜的內(nèi)面，在細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)細(xì)胞膜上的這種磷脂分布的不對稱性被破壞而使PS暴露在細(xì)胞膜外。Annexin V具有易于結(jié)合到磷脂類如PS的特性，對PS有高度的親和性。因此，該蛋白可充當(dāng)一敏感的探針檢測暴露在細(xì)胞膜表面的PS。PS轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外不是凋亡所*的，也可發(fā)生在細(xì)胞壞死中。兩種細(xì)胞死亡方式間的差別是在凋亡的初始階段細(xì)胞膜是完好的，而細(xì)胞壞死在其早期階段細(xì)胞膜的完整性就被破壞。另外一種活細(xì)胞非透過性熒光染料碘化丙啶不能通過完整的活細(xì)胞，但能夠?qū)乃篮偷蛲鐾砥诘募?xì)胞進(jìn)行染色，因此通常將Annexin V與PI配合染色，以區(qū)別凋亡早期細(xì)胞與壞死細(xì)胞和凋亡的晚期細(xì)胞。

操作步驟：

1、細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備：

a．對于貼壁細(xì)胞：小心收集細(xì)胞培養(yǎng)液到一離心管內(nèi)備用。用消化細(xì)胞，至細(xì)胞可以被輕輕用移液管或槍頭吹打下來時(shí)，加入前面收集的細(xì)胞培養(yǎng)液，吹打下所有的貼壁細(xì)胞，并輕輕吹散細(xì)胞。再次收集到離心管內(nèi)。1000×g左右離心3-5分鐘，沉淀細(xì)胞。對于特定的細(xì)胞，如果細(xì)胞沉淀不充分，可以適當(dāng)延長離心時(shí)間或稍稍加大離心力。小心吸除上清，可以殘留約50μl左右的培養(yǎng)液，以避免吸走細(xì)胞。加入約1ml 4℃預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞，再次離心沉淀細(xì)胞，小心吸除上清。再次加入1ml 4℃預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞，再次離心沉淀細(xì)胞。

b．對于懸浮細(xì)胞：1000×g左右離心3-5分鐘，沉淀細(xì)胞。對于特定的細(xì)胞，如果細(xì)胞沉淀不充分，可以適當(dāng)延長離心時(shí)間或稍稍加大離心力。小心吸除上清，可以殘留約50微升左右的培養(yǎng)液，以避免吸走細(xì)胞。加入約1ml 4℃預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移到1.5毫升離心管內(nèi)。再次離心沉淀細(xì)胞，小心吸除上清，可以殘留約50μl左右的PBS，以避免吸走細(xì)胞。再次加入1ml 4℃預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞，再次離心沉淀細(xì)胞。

2、用去離子水按1:3稀釋Binding Buffer(4ml Binding Buffer +12ml 去離子水)。

3、用 250μl Binding Buffer重新懸浮細(xì)胞，調(diào)節(jié)其濃度為 1×106/ml。

4、取 100μl的細(xì)胞懸液于 5ml 流式管中，加入 5μl Annexin V-Alexa Fluor 488 和10μl 20μg/ml的PI溶液。

5、混勻后于室溫避光孵育 15 分鐘。

6、在反應(yīng)管中加 400μl PBS，流式細(xì)胞儀(FACS)分析。

Annexin V-Alexa Fluor 488 PI雙染流式分析圖譜

Jurkat細(xì)胞用誘導(dǎo)凋亡后用Annexin V-Alexa Fluor 488/PI雙染流式分析圖譜

儲存條件：2～8℃，避光保存

細(xì)胞培養(yǎng)操作規(guī)程：

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1）準(zhǔn)備F-12K培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%。

2）培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

二．細(xì)胞處理：

1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準(zhǔn)備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

QQ截圖20220509112004.png

細(xì)胞培養(yǎng)方法：

1、細(xì)胞傳代：細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時(shí)即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個(gè)瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；若細(xì)胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集，細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2、細(xì)胞復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時(shí)間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基。

3、細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；

③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細(xì)胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時(shí)后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲存。

Avian Infectious Bronchitis Virus(AIBV)禽傳染性支氣管炎病毒Delaware型染料法熒光定量RT-PCR試劑盒動(dòng)物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次低溫負(fù)20度一年 2-3周

Plasmodium spp.瘧原蟲通用探針法熒光定量PCR試劑盒動(dòng)物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次低溫負(fù)20度一年 2-3周

Radix astragali黃芪LAMP鑒定試劑盒中藥材鑒定試劑盒/定做種屬檢測試劑盒 50次低溫負(fù)20度一年 2-4周

Giardia intestinalis腸賈第蟲LAMP試劑盒動(dòng)物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次低溫負(fù)20度一年 2-3周

Avian Leukosis Virus(ALV)禽白血病病毒E亞群RT-LAMP試劑盒動(dòng)物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次低溫負(fù)20度一年 2-3周

Thallus laminariae昆布PCR鑒定試劑盒中藥材鑒定試劑盒/定做種屬檢測試劑盒 50次低溫負(fù)20度一年 2-4周

St.Louis Encephalitis Virus(SLEV)圣路易斯腦炎病毒RT-LAMP試劑盒動(dòng)物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次低溫負(fù)20度一年 2-3周

Pericarpium zanthoxyli花椒LAMP鑒定試劑盒中藥材鑒定試劑盒/定做種屬檢測試劑盒 50次低溫負(fù)20度一年 2-4周

Fructus momordicae羅漢果PCR鑒定試劑盒中藥材鑒定試劑盒/定做種屬檢測試劑盒 50次低溫負(fù)20度一年 2-4周

Ornithostrongylus quadriradiatus四輻射鳥圓線蟲LAMP試劑盒動(dòng)物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次低溫負(fù)20度一年 2-3周

Dermanyssus gallinae雞皮刺螨探針法熒光定量PCR試劑盒動(dòng)物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次低溫負(fù)20度一年 2-3周

Arcanobacterium haemolyticum溶血隱秘桿LAMP試劑盒動(dòng)物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次低溫負(fù)20度一年 2-3周

Alexa Fluor 488/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒耦聯(lián)比色法定量檢測試劑盒

有機(jī)磷細(xì)菌培養(yǎng)基英文名稱：Bacterial organophosphorus Medium 產(chǎn)品規(guī)格：250g

細(xì)胞纖維蛋白溶原激活劑抑制物（PAI）活性化學(xué)發(fā)光法定量檢測試劑盒 20次

冰凍切片組織COLLAGEN II蛋白表達(dá)NBT顯色光學(xué)顯微鏡檢測試劑盒 10/20次

血液超氧化物陰離子比色法定量檢測試劑盒 20次

支原體培養(yǎng)基英文名稱：Mycoplasma Medium 產(chǎn)品規(guī)格：250g

石蠟切片結(jié)締組織（CONNECTIVE TISSUE）格莫瑞（Gomori）染色試劑盒 50次

超白金TAG DNA聚合 200 U

石蠟切片磷脂尼羅紅（Nile Red）間接熒光染色試劑盒 10次

真/酵母a-淀粉（a-AMYLASE）活性CNPG3比色法定量檢測試劑盒 20次

SS瓊脂顆粒英文名稱：SS Agar 產(chǎn)品規(guī)格：300ml/袋*10

操作規(guī)程

1、在96孔板加入細(xì)胞100μL/孔，通常細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升2000個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升5000～10000個(gè)細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí).

2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時(shí)間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時(shí)，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標(biāo)儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細(xì)胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細(xì)胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細(xì)胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細(xì)胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細(xì)胞的OD 值，C 為對照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率% =（加藥細(xì)胞OD/對照細(xì)胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時(shí)的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時(shí)的藥物濃度(IC90)