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ELISA試劑盒方法與硝酸纖維素膜微粒介紹

時間:2014/8/26閱讀:608
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1 實驗方法
1.1 混合抗原直接測試
按豚鼠膜迷路蛋白抗原性分析文章講述的方法[1],將1.2ml大鼠原血清加入7.0ml10%丙烯酰胺溶液,聚合后在10°C、200mA、2h條件下大鼠血清蛋白電泳吸附于NC膜,用蒸餾水漂洗后,切一10×100mm小條裝入10ml試管備用。對照組將同樣面積空白NC膜用蒸餾水漂洗后備用。在上述裝有NC膜的試管中加入10ml DMSO,充分搖勻,室溫1h;加入等體積0.1mol/L pH9.0碳酸氫鈉溶液,充分混勻。3000r/min離心3~5min,收集沉淀,即為含大鼠血清蛋白的NC膜微粒,用0.01mol/L pH7.4 PBS-T洗滌離心3×5min;用含0.3%的1:50正常羊血清封閉、阻斷37°C30min或4°C冰箱過夜;同上離心后用PBS將微粒體積調至5ml、用0.5ml離心管分裝,每管加入100μl微粒懸濁液;在各管中分別加入100μl倍比稀釋的HRP-羊抗鼠,37°C孵育30min;同上洗滌離心3次,加入100μl含0.1mol/L檸檬酸、0.2mol/L磷酸氫二鈉、雙氧水、鄰苯二胺底物溶液,于37°C暗環境反應120min;每管加入1滴2mol/L硫酸終止反應,同上離心,收集上清并加入96孔ELISA試劑盒酶聯板,用酶標儀測試波長490nm處OD值。重復測試3次。

1.2 電泳分離抗原測試
首先免疫轉印鑒定抗原,再根據免疫轉印結果進行定位,將特定抗原帶裁下,測量NC膜面積,同上將NC膜微粒化處理并進行定量免疫測試。

2 實驗結果

用混合抗原直接測試和用電泳分離抗原進行測試,抗體濃度與OD值間均有較好線性關系,當抗體濃度為0.25~1.0ng/ml時線性,且陽性組和陰性對照組OD值落在*范圍(見表1),即陰性對照組OD值為0.3左右,陽性對照組為1.0左右。3次重復結果一致。
 

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