免疫熒光實驗原理很簡單，其實就是使用熒光二抗，并在熒光顯微鏡下采集圖像，其它的和IHC或ICC區別不大。實驗過程常見問題分析：

1、目標蛋白的熒光很弱，導致組間差異并不明顯，造成假陰性結果

這種情況出現后，首先要檢查一下抗體對不對，是否適用于你的預處理組織。一個典型的例子就是，有些抗體只適用于冰凍切片，但若將其應用于石蠟切片，就會造成弱標記或無標記現象。

然后通過文獻等查找一下目標蛋白在該組織或細胞的表達豐度如何。若該蛋白本身表達就很少，那就沒啥可說的，你的結果應該沒問題。

此外，如果抗體修復不充分，抗原表位未全暴露，也會出現弱標記現象。比如，盡管大多數抗體都是在酸性環境中修復，但是也存在少量的抗體需要在堿性環境中修復，建議查看抗體說明書，嚴格按照其修復條件進行實驗。

2、目標蛋白的熒光太強，甚至形成非特異性的標記，一些背景染色可能被誤認為陽性區域，造成假陽性結果

這種情況一般出現在抗體濃度過高而漂洗又不充分的時候。多余的抗體會吸附在組織上，造成熒光圖像整體高背景。

改進方法是適當降低一抗或者二抗的濃度，增加漂洗時間，一般能夠有所改善。

3、DAPI染細胞核時，加入的試劑太多，造成高背景染色

現在都是使用的防熒光衰減DAPI試劑，使用時滴上一滴就能將細胞核標記。

但是這也帶來一個小問題。滴加的量太多時，會造成整張圖像呈現出藍色的背景。采集得到的圖像會很不好看，如果單純使用γ值曲線去調整，圖像中的細胞核會呈現出假假的感覺，像是P上去的。

因此，滴加的DAPI不要太多，只需覆蓋上薄薄的一層即可。事實上，個人認為只要切片沒有暴露在自然光或者激發光之下，熒光的自然衰減并沒有想象中那么快。

4、組織切片預處理不當或采用石蠟切片，導致高背景染色

如果組織切片，尤其是石蠟切片脫蠟環節不徹di，也會造成區域性的非特異性標記。建議脫蠟一定要徹di，脫蠟前充分烤片也可以幫助脫蠟。

實驗過程中，玻片干燥了，同樣會造成高背景或大面積的非特異性標記。漂洗環節和抗體孵育環節最容易出現干片現象，尤其是大批量實驗時，一定要注意。使用免疫組化專用筆畫個圈，可以有效改善。

5、采集圖像過程不當，導致原始圖像不佳，直接影響后續半定量分析

采集圖像時不要對每一張圖像都加上標尺，否則后期采用Image J或者IPP進行分析時，這些標尺會對結果造成影響。

采集圖像時，速度要快。如果激發光很長時間對準目標區域，此區域內的熒光衰減會極快，有經驗的人都知道，不必多說。因此，目標區域較小時，一定要盡量快速采集，減少人為實驗誤差。

采集圖像時，必須固定一個γ值，不可以在采集過程中修改。因為，γ值確實可以改善圖像的某些瑕疵，但是這樣一來，圖像的熒光分布和強度會受到γ值的極大影響。調整幅度太大，更會造成熒光假假的感覺，非常失真。

當然了，后期半定量分析時，如果一定要調整γ值，那也是對整批次圖像的統一調整，而不是某幾張圖像。千萬別走入造假的險境之中。