ELISA試劑盒的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又保留酶的活性。ELISA試劑盒在測定時，受檢標本(測定其中的抗體或抗原)與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與液體中的其他物質分開。
1 將特異性抗體與固相載體聯結，形成固相抗體。洗滌除去未結合的抗體及雜質。
2 加受檢標本，保溫反應。標本中的抗原與固相抗體結合，ELISA試劑盒形成固相抗原抗體復合物。 洗滌除去其他未結合物質。
3 加酶標抗體，保溫反應。固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。*洗滌未結合 的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢抗原的量相關。
4 加底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產物。通過比色，測知標本中抗原的量。 在臨床檢驗中，此法適用于檢驗各種蛋白質等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要獲得針對受檢抗原的異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶結合物而建立此法。ELISA試劑盒如抗體的來源為抗血清，包被和酶標用的抗體分別取自不同種屬的動物。如應用單克隆抗體，一般選擇兩個針對抗原上不同決定簇的單抗，分別用于包被固相載體和制備酶結合物。這種雙位點夾心法具有很高的特異性，而且可以將受檢標本和酶標抗體一起保溫反應，作一步檢測。
