一、基本知識與原理
轉(zhuǎn)導是以噬菌體為媒介將一個細胞的遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移給另一個細胞的過程。隨著分子遺傳學的發(fā)展，轉(zhuǎn)身已成為基因精細結(jié)構(gòu)分析的常用方法之一。
根據(jù)噬菌體轉(zhuǎn)導供體菌基因的差異，轉(zhuǎn)導可分為普遍性轉(zhuǎn)導和局限性轉(zhuǎn)導。這里以局限性轉(zhuǎn)導為例說明轉(zhuǎn)導的基本原理。局限性轉(zhuǎn)導實驗中常用的是大噬菌體，它能整合在大腸桿菌染色體DNA上的半乳糖基因（gAl）和生物素基因（bib）之間，因此，它能轉(zhuǎn)導半乳糖基因（一）又能轉(zhuǎn)導生物素基因（bio）。
本實驗選用大腸桿菌 E。oh K．2（A）為供體菌（即大噬菌體的DNA已整合在大腸桿菌的DNA上，我們稱該大腸桿菌為溶源性大腸桿菌，’gAT””為帶有半乳糖基因）。由于在此供體菌中噬菌體與半乳糖基因（匆”）緊密連鎖，因此，當此供體菌受紫外線照射后會產(chǎn)生裂解反應，噬菌體被誘發(fā)釋放，以一定的比例形成帶有半乳糖基因的轉(zhuǎn)導噬菌體。當這種轉(zhuǎn)導噬菌體與受體菌 ECo］i K；。 s gAl－（此細菌不能利用半乳糖，‘’表示此細菌半乳糖基因發(fā)生突變）混合接觸時，帶有一基因的轉(zhuǎn)導噬菌體能以一定的頻率整合到受體首上，從而使不能利用半乳糖的 gAl一受體菌轉(zhuǎn)變成了能利用半乳糖的 gAT”細菌。整個過程可用圖12－’表示：
L6 大鼠成肌細胞
L6565 小鼠白血病克隆細胞系
Lec1 倉鼠卵巢細胞
Li-7 人肝癌細胞
LLC 小鼠肺癌細胞
LLC-MK2 恒河猴腎細胞
LNCaP clone FGC 人前列腺癌細胞
LoVo 人結(jié)腸癌細胞
LS 174T 人結(jié)腸腺癌細胞
LTEP-a-2 人肺腺癌細胞
M-20 人胚胎成纖維細胞
M-22 人胚胎成纖維細胞
M-7 人胚胎成纖維細胞
MC3T3-E1 Subclone 14 小鼠顱頂前骨細胞亞克隆14
MCF7 [MCF-7] 人乳腺癌細胞
MDA-MB-231 人乳腺癌細胞
MDA-MB-415 人乳腺腺癌細胞
MDA-MB-435S 人乳腺導管癌
MDA-MB-436 人乳腺腺癌細胞
MDA-MB-453 人乳腺癌細胞
MDA-MB-468 人乳腺癌細胞
MDBK (NBL-1) 牛腎細胞
MDCK(NBL-2) 狗腎細胞
ME-180 人子宮頸表皮癌細胞
MEG-01 人成巨核細胞白血病細胞
MFC 小鼠胃癌細胞
MG-63 人骨肉瘤細胞
MGC80-3 人胃癌細胞
MLTC-1 小鼠睪丸間質(zhì)細胞瘤細胞
MNNG/HOS Cl #5 [R-1059-D] 人骨肉瘤細胞
MOLT-4 人急性淋巴母細胞白血病細胞
Mo-MuLV/3T3 小鼠Mo-MuLv感染的3T3細胞
MR1 [derivative of HB-11048] 中國倉鼠X小鼠B淋巴細胞雜交瘤
MRC-5 人胚肺細胞
MS1 小鼠胰島內(nèi)皮細胞
MS751 人子宮頸表皮癌細胞
MSTO-211H 人肺癌細胞株
Mv.1.Lu(NBL-7) 貂肺上皮細胞
NAMALWA 人Burkitt's淋巴瘤細胞
NCI-H1299 人非小細胞肺癌細胞
NCI-H1395 人肺腺癌細胞
NCI-H1650 人非小細胞肺癌細胞
NCI-H1688 人經(jīng)典小細胞肺癌細胞
NCI-H1975 人肺腺癌細胞
NCI-H292 人肺癌細胞(淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)
NCI-H358 人非小細胞肺癌細胞
NCI-H446 [H446] 人小細胞肺癌細胞
NCI-H460 [H460] 人大細胞肺癌細胞
NCI-H661 人大細胞肺癌細胞
NCI-H716 [H716] 人結(jié)直腸腺癌細胞
NCI-N87 [N87] 人胃癌細胞
NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L] 小鼠成纖維細胞
Neuro-2a [N2a; Neuro-2a] 小鼠腦神經(jīng)瘤細胞
NG108-15 [108CC15] 小鼠神經(jīng)細胞瘤與大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤之融合細胞
NIH/3T3 小鼠胚胎細胞
NIH:OVCAR-3 人卵巢癌細胞
NK-92MI 人惡性非霍奇金淋巴瘤患者的自然殺傷細胞,
NK-92 人惡性非霍奇金淋巴瘤患者的自然殺傷細胞,
NR8383 大鼠肺泡巨噬細胞
NRK 大鼠腎細胞
OP9 小鼠骨髓基質(zhì)細胞
OS-RC-2 人腎癌細胞
P19 小鼠畸胎瘤細胞
P3/NSI/1-Ag4-1 [NS-1] 小鼠骨髓瘤細胞
P388D1 小鼠淋巴樣瘤細胞
P3X63Ag8 小鼠骨髓瘤細胞
二、實驗目的和要求
以局限性轉(zhuǎn)導為例來說明轉(zhuǎn)導的基本原理，進一步驗證是遺傳物質(zhì)，并初步掌握轉(zhuǎn)導實驗的基本方法。
三、實驗器材
實驗材料：供體菌 受體菌
實驗試劑：肉湯液體培養(yǎng)基、肉湯固體培養(yǎng)基、ZE 肉湯液體培養(yǎng)基、半固體瓊脂培養(yǎng)基、半乳糖Emb培養(yǎng)基、滅菌生理鹽水（或磷酸緩沖液）
實驗設備：培養(yǎng)皿（9厘米）、三角燒瓶（50毫升）、試管、離心管，離心機，移液管，涂棒，水浴鍋，離心機，紫外照射箱、溫箱
四、實驗方法與步驟
1 噬菌體的誘導和裂解液的制備
供體菌的活化與培養(yǎng)，取—環(huán)供體菌，接種于盛有sml肉湯液體培養(yǎng)基的三角瓶中37度培養(yǎng)16h后，吸取0.5毫升菌液，接種于盛有肉4.5毫升肉湯液體培養(yǎng)基的三角瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)4～6小時。
制備懸浮液將三角瓶中的菌液倒人離心管，以 3 500 rlmlN， 離心 10 miN。離心后，除去上清液，加 4ml磷酸緩沖液，混勻沉淀，再以 3 smr/miN，離心 10。i。，這樣反復洗三次，制備成懸浮液。
誘導裂解：取懸浮液 3。；i于培養(yǎng)皿中，經(jīng) UV處理（15 W，距離 40Cm），誘導 10－20。
避光培養(yǎng)； UV處理后，加人 3 ml ZE肉湯液體培養(yǎng)基，為了防止光復活，立即置于37 T避光培養(yǎng) 2－3 h．
制備裂解液：吸取培養(yǎng)物于離心管中，以 3 500 r/rUiN，離心 10 miN，吸取上清液，再加人02 ml氯仿（4－5滴），激烈振蕩30 s，靜置5 mlN，再次以 3 55 r/miN，離心 10 mlN，小心把上清波用無菌吸管轉(zhuǎn)移到另一試管，這就是噬菌體（A） gAl”的裂解液。
轉(zhuǎn)導方法
點滴法：
①取倒好Emb培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿2只，在皿底用記號筆按圖中的樣子 畫好。
②取一滿環(huán)受體菌，涂出一條菌帶，共涂二條， 37 T培養(yǎng) 15 ho ＠取出培養(yǎng)皿
在2個圓圈和四個方格處，各加一環(huán)噬菌體裂解液，2個圓圈作為對照，四個方格作為
轉(zhuǎn)導處理，見圖 12—2，培養(yǎng) 2 D，觀察結(jié)果。
涂布法：
①取倒好的Emb培養(yǎng)皿三只，先做好標記，其中一加 oJ ml噬菌體裂解液，用于對照Z一只加 oJ ml受體菌，也用于對照，一只加噬菌體裂解液和受體菌液各 005 ml、
②用玻璃涂棒將各皿上的菌液（或噬菌體裂解液）涂開，相同的2只培養(yǎng)皿用同一根玻璃涂棒，37 T培養(yǎng) 2 D，觀察結(jié)果。
