BD培養基 核酸的提取
核酸包括DNA、RNA兩種分子,在細胞中都是以與蛋白質結合的狀態存在,核酸提取的主要步驟為:
裂解細胞
去除與核酸結合的蛋白質以及多糖、脂類等生物大分子,去除其他不需要的核酸分子,如提取DNA分子時,應去除RNA,反之亦然。
沉淀核酸
純化核酸,去除鹽類,有機劑等雜質
BD培養基 核酸的提取(一)DNA提取的經典方法
DNA提取的經典方法,即所謂的酚-氯仿提取法。因為使用兩種不同的有機溶劑交替抽提更容易將蛋白除去,提取次序為酚、酚/氯仿(1:1)、氯仿,這種方法提取的DNA純度高、片段大、效果好,缺點是較為繁瑣。
說明:
回收上層水相時,一定不要接觸兩相的界面,以免將蛋白質等物質吸入新離心管。
沉淀DNA,無水乙醇是的有機溶劑。另:異丙醇、醋酸鈉等。
70%乙醇漂洗DNA,是為了去除殘余的鹽類,去除過量SDS和酚等雜物,因為SDS在70%的乙醇中保持溶解狀態,不與DNA共沉淀,從而通過棄上清液去除這種去污劑,避免對以后PCR反應的影響。
TE緩沖液:10mmol/L Tris-Hcl
1mmol/L EDTA pH 8.5或 8
BD培養基 核酸的提取RNA的提取
RNA提取條件較DNA要求嚴格,主要是因為臨床標本及實驗室環境中,存在大量對RNA有強烈降解作用RNase。RNase是一類生物活性非常穩定的酶類。這種酶耐酸、耐堿、耐高溫,如煮沸也不能使之*失活。
蛋白質變性劑可使之暫時失活,但變性劑去除后,又可恢復活性。除細胞內RNase以外,環境中灰塵、各種實驗器皿和試劑、人體的汗液及唾液中均存在RNase,因此在提取RNA時,關鍵要避免RNase對標本的污染及防止RNase對提取的RNA的降解。
1.提取RNA所用器皿的處理及溶液的準備
塑料制品:如試管、EP管、Tip頭,使用滅菌的一次性用品。
玻璃用品:如燒杯、試管和其他用品,常被RNase污染,使用前必須于180oC干燥8小時以上,或用0.1轕C水(焦碳酸二乙酯)浸泡處理。
DEPC是RNase的強抑制劑,作用機制是通過與蛋白質中的組氨酸結合,使蛋白質變性。37℃浸泡2小時,然后用滅菌水漂洗數次,于100℃干烤15分鐘,去除器皿上殘余DEPC。
所需溶液的配制:必須用高壓滅菌的水和RNA提取的化學試劑配制溶液,用干烤過的藥匙稱取試劑,把溶液裝入無RNase的玻璃器皿。
嚴格來說,所有溶液均應用0.1轕C于37℃處理12小時以上,然后于100℃加熱15分鐘或高壓滅菌15分鐘,去除殘余DEPC。
2.RNA提取中RNase污染的控制
zui主要的潛在污染源是操作人員的手,手直接觸摸之處毫無疑問會留下RNase,另外,說話帶出的唾液也富含RNase,故在涉及RNA的一切操作過程中,都應戴一次性手套和口罩。
實驗中,如接觸了“臟的”玻璃器皿和其他物品以后,手套就可能污染RNase,因此RNA提取實驗中,應勤換手套。
RN A提取方法