組織培養(yǎng)物的繼代培養(yǎng) 傳代細(xì)胞
材料和設(shè)備
材料 從培養(yǎng)4-6周的外植體上長(zhǎng)出的愈傷組織、叢生芽或胚狀體
超凈工作臺(tái)
培養(yǎng)基 N6+0.5 mg/L 2,4-D N6+2 mg/L 6-BA(也可以自已設(shè)計(jì))
三角瓶、帶有吸水紙的成套的培養(yǎng)皿、鑷子、解剖刀
70%酒精、95%酒精及70%的酒精棉球
酒精燈、火柴、記號(hào)筆、酒精噴壺
組織培養(yǎng)物的繼代培養(yǎng) 傳代細(xì)胞二、方法步驟
1 取材 在無(wú)菌室的超凈工作臺(tái)內(nèi),每次取一瓶培養(yǎng)物,灼燒培養(yǎng)瓶口約20 毫米處,用灼燒冷卻后的鑷子和解剖刀,取出外植體或者愈傷組織放在無(wú)菌的培養(yǎng)皿中。每個(gè)培養(yǎng)皿中約放4-6個(gè)外植體或者愈傷組織。把每塊愈傷組織分成兩、三個(gè)不小于5 mm見(jiàn)方的小塊。外植體下面向著中心的細(xì)胞常呈壞死狀,不適宜作繼代培養(yǎng)。這些壞死的部分應(yīng)當(dāng)與正常的部分分離并棄去。每次操作后要去掉用過(guò)的吸水紙并重新蓋上培養(yǎng)皿的蓋子。
2 繼代轉(zhuǎn)接 將正在發(fā)育的外植體或愈傷組織轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基上,接種方法同前。轉(zhuǎn)接后在培養(yǎng)瓶上寫(xiě)明培養(yǎng)物、培養(yǎng)基、日期。長(zhǎng)期培養(yǎng)的胡蘿卜組織會(huì)產(chǎn)生大塊愈傷組織。正在發(fā)育的愈傷組織作*次繼代培養(yǎng)所用的實(shí)驗(yàn)程序與以后每隔四周轉(zhuǎn)移一次建成愈傷組織系的繼代培養(yǎng)程序相同。
3 實(shí)驗(yàn)記錄 將實(shí)驗(yàn)記錄抄錄于筆記本上,注明實(shí)驗(yàn)開(kāi)始的日期、持續(xù)期、培養(yǎng)物的數(shù)目、污染數(shù)目和所作的不同處理。在四星期內(nèi),每隔一星期用肉眼觀(guān)察培養(yǎng)物,記錄培養(yǎng)物形態(tài)的變化,培養(yǎng)物的生長(zhǎng)狀態(tài)、鮮重變化等,必要時(shí)作拍照記錄。