小鼠血細(xì)胞，WEHI-3細(xì)胞 *

一、原理
細(xì)胞周期指細(xì)胞一個世代所經(jīng)歷的時間。從一次細(xì)胞分裂結(jié)束到下一次分裂結(jié)束為一個周期。細(xì)胞周期反應(yīng)了細(xì)胞增殖速度。
單個細(xì)胞的周期測定可采用縮時攝影的方法，但它不能代表細(xì)胞群體的周期，故現(xiàn)多采用其他方法測群體周期。
測定細(xì)胞周期的方法很多，有同位素標(biāo)記法、細(xì)胞計數(shù)法等，這里介紹一種利用BrdU滲入測定細(xì)胞周期的方法。
BrdU（5-溴脫氧尿嘧啶核苷）加入培養(yǎng)基后，可做為細(xì)胞DNA復(fù)制的原料，經(jīng)過兩個細(xì)胞周期后，細(xì)胞中兩條單鏈均含BrdU的DNA將占l/2，反映在染色體上應(yīng)表現(xiàn)為一條單體淺染。如經(jīng)歷了三個周期，則染色體中約一半為兩條單體均淺染，另一半為一深一淺。細(xì)胞如果僅經(jīng)歷了一個周期，則兩條單體均深染。計分裂相中各期比例，就可算出細(xì)胞周期的值。

二、儀器、用品與試劑  小鼠血細(xì)胞，WEHI-3細(xì)胞 *
1、儀器、用品：同常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)
2、試劑：BrdU（1.0mg/ml），甲醇、冰醋酸，Giemsa染液，秋水仙素，2×SSC液

三、操作步驟
1、細(xì)胞生長至指數(shù)期時，向培養(yǎng)液中加入BrdU，使zui終濃度為10μg/ml。
2、44小時加秋水仙素，使每ml中含0.1μg。
3、48小時后常規(guī)消化細(xì)胞至離心管中，注意培養(yǎng)上清的漂浮細(xì)胞也要收集到離心管中。
4、常規(guī)染色體制片（見第三部分：染色體技術(shù)）。
5、染色體玻片置56℃水浴鍋蓋上，鋪上2×SSC 液，距紫外燈管6cm處紫外照射30分鐘。
6、棄去2×SSC液，流水沖洗。
7、Giemsa液染色10分鐘，流水沖洗，晾干。
8、鏡檢100個分裂相，計*、二、三、四細(xì)胞期分裂指數(shù)。
9、計算：細(xì)胞周期（Tc）=48/{（M1+2M2+3M3+4M4）/100}（小時）
附：（1）BrdU配制: BrdU 10mg十雙蒸水10ml   4℃下避光保存。
（2）2×SSC配制： NaCl 1.75克，檸檬酸三鈉-2H2O0.88克，加水至100ml，4℃保存。

細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇  小鼠血細(xì)胞，WEHI-3細(xì)胞 *
一、原理
在不加任何條件下直接凍存細(xì)胞時，細(xì)胞內(nèi)和外環(huán)境中的水都會形成冰晶，能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)發(fā)生機械損傷、電解質(zhì)升高、滲透壓改變、脫水、PH改變、蛋白變性等，能引起細(xì)胞死亡。如向培養(yǎng)液加入保護(hù)劑，可使冰點降低。在緩慢的凍結(jié)條件下，能使細(xì)胞內(nèi)水份在凍結(jié)前透出細(xì)胞。貯存在-130℃以下的低溫中能減少冰晶的形成。
細(xì)胞復(fù)蘇時速度要快，使之迅速通過細(xì)胞zui易受損的-5～0℃，細(xì)胞仍能生長，活力受損不大。
目前常用的保護(hù)劑為二甲亞砜（DMSO）和甘油，它們對細(xì)胞無毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細(xì)胞。

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