Caspase-8 Activity Assay Kit (Fluorometric)
Caspase-8活性檢測試劑盒（熒光法）
產品信息
產品名稱 | 產品編號 | 規格 | 價格（元） |
Caspase-8活性檢測試劑盒（熒光法） | MX3233-20T | 20T | 930 |
Caspase-8活性檢測試劑盒（熒光法） | MX3233-100T | 100T | 2980 |
產品描述
Caspases（Cysteine-requiring Aspartate Proteases）是一個高度保守的半胱an酸蛋白酶家族，特異性識別底物中的天冬氨酸殘基，在介導細胞凋亡的過程中發揮著非常重要的作用。Caspases以潛在酶原的形式表達，通過自發蛋白分解機制或經其他蛋白酶（通常是其他caspases）加工處理的方式被活化。人caspases可細分為三大功能組：細胞因子活化（caspase-1，-4，-5和-13），凋亡啟動（caspase-2，-8，-9和-10）和凋亡執行（caspase-3，-6和-7）。
Caspase-8（Caspase 8），也稱為Mch5，MACH和FLICE，位于caspase級聯層次結構的頂端，是“上游”成員或caspases的啟動家族。以無活性酶原的形式存在細胞內，分子量55kDa。一旦募集到死亡受體胞漿結構域（比如Fas），通過配體蛋白FADD，即被激活，形成一個由18kDa和12kDa亞基組成的二聚體，進一步激活下游的caspases（-3，-6和-7），進而切割關鍵的細胞底物，導致細胞凋亡性死亡。
Caspase-8活性檢測試劑盒（熒光法）（Caspase-8 Activity Assay Kit, Fluorometric or Caspase-8 Fluorometric Assay Kit）以偶聯上發色基團AFC的caspase-8序列特異性的多肽為底物。當底物被caspase-8剪切后，發色基團被釋放出來，進而用熒光酶標儀來測定其熒光強度（激發波長=485nm，發射波長=535nm）。通過計算RFU凋亡誘導組/RFU陰性對照組的比值來確定凋亡誘導組caspase-8的活化程度。
本品適用于培養細胞以及新鮮組織的caspase-8活性檢測。
產品包裝
編號 | 組分名稱 | 保存方法 | 貨號（規格） | |
MX3233-20T | MX3233-100T | |||
MX3233-A | Lysis Buffer 裂解緩沖液 | 2-8℃ | 5ml | 20ml |
MX3233-B | 2× Reaction Buffer 2×反應緩沖液 | 2-8℃ | 2ml | 10ml |
MX3233-C | Caspase-8 Substrate Caspase-8底物 | -20℃避光 | 6μl | 30μl |
MX3233-D | 0.1M DTT | -20℃避光 | 60μl | 250μl |
保存與運輸方法
保存：-20℃保存，1年有效。開盒后置Lysis Buffer和2× Reaction Buffer于2-8℃保存。Caspase-8 Substrate和0.1M DTT需要避光凍存。
運輸：冰袋運輸。
注意事項
1） Caspase-8 Substrate需避光保存和使用。
2） 某些凋亡誘導劑誘導的凋亡可能通過caspase-8非依賴的方式進行，此種情況使用本品檢測的caspase-8活性無明顯變化，則，需要考慮凋亡機制中的其他信號通路。
3） 起始細胞數量需達3~5×106個或新鮮組織量達50~100mg，以保證達到測定所需的100~200μg蛋白量。Caspase-8的活性與細胞裂解后的蛋白含量有關，如測定的RFU值偏低，可通過適當延長反應時間來操作。但如果測定的RFU值依然不高，則要通過增加細胞數量或組織量的方法來提高蛋白量。
4） 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
使用方法
1. 需要的其他試劑和材料
儀器：低溫高速離心機、熒光酶標儀、微量移液器、玻璃勻漿器（組織樣本）
耗材：1.5ml微量離心管、白色或黑色（不透明、平底）的96孔酶標板
試劑：PBS、蛋白定量試劑（比如：Bradford法蛋白濃度測定試劑盒）、ddH2O
2. 試劑準備
2.1 Lysis Buffer（含DTT）
于實驗前，按每50μl Lysis Buffer 加入0.5μl DTT的比例準備足量的裂解工作液，置于4℃或冰上待用。
2.2 2×Reaction Buffer（含DTT）
于使用前，按每50μl 2×Reaction Buffer 加入0.5μl DTT的比例準備足量的反應工作液。
2.3 Caspase-8 Substrate工作液
將Caspase-8 Substrate從冰箱內取出，置于室溫（或25℃水浴）使其充分融化，低速離心使其沉至管底。于使用前，按照19.5μl 2×Reaction Buffer 加入0.5μl Caspase-8 Substrate的比例準備足量的Caspase-8 Substrate工作液。
3. 樣本準備
3.1 細胞裂解
a）用合適方法誘導細胞凋亡，同時設立陰性對照組（不加誘導劑），收集3~5×106個細胞。
b）PBS洗滌細胞2次（2000rpm，離心5min），盡量吸盡PBS上清。
c）往離心的沉淀細胞中加入100μl預冷的Lysis Buffer（含DTT），吹打混勻。
d）置冰上裂解20~60min，其間渦旋振蕩3~4次，每次10s；或凍融2~3次。
e）4℃，10,000rpm離心1min。
f）小心吸取上清（含裂解釋放的蛋白質）轉移到新的EP管內，置于冰上待用。
g）取少量上清（1~2μl），用常規方法（Bradford法）測定蛋白濃度。
3.2 組織裂解
a）取50~100mg組織置于培養皿內，用手術剪剪碎成3mm×3mm左右的小塊，加入150~200μl預冷的Lysis Buffer（含DTT），用玻璃勻漿器上下手動勻漿15次，注意低溫操作。
b）將組織勻漿液轉移到1.5ml預冷的離心管，10,000rpm，4℃離心5min。
c）小心吸取上清（含裂解釋放的蛋白質）轉移到新的EP管內，置于冰上待用。
d）取少量上清（1~2μl），用常規方法（Bradford法）測定蛋白濃度。
4. Caspase-8活性檢測
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